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2015 Fiscal Year Research-status Report

オッセオインテグレーションとバイオインテグレーションの本質を細胞サイドから探る

Research Project

Project/Area Number 15K15741
Research InstitutionThe University of Tokushima

Principal Investigator

宮本 洋二  徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (20200214)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 玉谷 哲也  徳島大学, 大学病院, 講師 (30274236)
高丸 菜都美  徳島大学, 大学病院, 助教 (40513031)
永井 宏和  徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 准教授 (50282190)
大江 剛  徳島大学, 大学病院, 助教 (60432762)
Project Period (FY) 2015-04-01 – 2017-03-31
Keywordsヒト骨髄間葉系幹細胞 / マイクロアレイ解析 / イオンプレーティング法
Outline of Annual Research Achievements

イオンプレーティング法を用いることによって、ガラスディッシュ表面にチタン、金およびステンレスをコーティングして、表面粗さや表面形状が同一で材質だけがことなる試料を作成した。これらディッシュ(チタン、金、ステンレス、ガラス)上で、ヒト骨髄間葉系幹細胞(hMSC-BM: Promo Cell No C-12974)を6時間培養し、RNAを回収した。cDNAのマイクロアレイを用いて、遺伝子の発現を解析した。遺伝子発現変化の網羅的解析はtoal RNAを逆転写してcDNAを作製後、Affymetrix社製 Gene Chip cDNAマイクロアレイキットを用いて解析し、発現変化を認めた候補遺伝子が確認できた。チタン上で2倍以上の発現変化を示した遺伝子を検索し、ガラスに対して78遺伝子、金に対して115遺伝子、ステンレスに対して115遺伝子を同定した。さらに、total RNAをTaqMan® cDNA Reverse Transcription (RT) Kit(Applied Biosystems)により逆転写し、ABI PRISM 7000 Sequence Detection SystemとTaqMan®Gene Expression AssaysによるリアルタイムPCR法を用いてmRNAレベルでの発現を確認中である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ガラスディッシュ表面をチタン、金、ステンレスでコーティングして、ヒト骨髄間葉系幹細胞を培養し、マイクロアレイによる解析を行い、発現変化を認めた候補遺伝子が確認した。さらに候補遺伝子のmRNAレベルでの発現をリアルタイムPCR法にて確認した。本年度の計画では、タンパクを回収し、標的タンパクの発現確認までを予定していたが、細胞の増殖とガラスディッシュのコーティングに時間を要したが、順調に進行している。

Strategy for Future Research Activity

ディッシュ(チタン、金、ステンレス、ガラス)上で、ヒト骨髄間葉系幹細胞を6時間培養し、RNAを回収する。Affymetrix社製human miRNAマイクロアレイキット(V2)を用い、miRNAの発現を解析する。候補となったmiRNAをリアルタイムPCR法を用いて発現を確認する。
miRNAマイクロアレイ時と同様の条件で、各種ディッシュ上で培養したhMSC-BMからタンパクを回収し、Western Blotting法により標的タンパクの発現を検討する。このとき、標的タンパクの発現を大きく変化させた候補miRNAを選択し、リアルタイムPCRを用いて候補遺伝子の発現を確認し、候補mRNAに対する標的タンパクの発現確認を行う。また、候補miRNAの標的タンパクに対する抗体を用いて発現の確認を行う。さらに、ヒト間葉系幹細胞をターゲットとして遺伝子およびmRNA発現を解析するだけでなく、骨芽細胞を用いて同様の研究をすすめていく。

Causes of Carryover

マイクロアレイ解析による候補遺伝子を確認したが、miRNA、タンパク発現の確認には至っておらず、次年度の課題とした。そのため、miRNA , Western Blotting法に使用する試薬・機器の購入ができていないためである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

miRNAマイクロアレイを行う。また、各種ディッシュ上で培養したhMSC-BMからタンパクを回収し、Western Blotting法により標的タンパクの発現を検討する。miRNAとWestern Blotting法に使用する試薬・機器の購入を予定している。

URL: 

Published: 2017-01-06  

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