齲蝕原因菌のグローバルレギュレーションシステムに関与する新規遺伝子制御機構の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K15756
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 香西 克之 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 教授 (10178212)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 光畑 智恵子 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 准教授 (10335664)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ミュータンスレンサ球菌 / デグラドソーム / 環境適応 / 齲蝕

Outline of Annual Research Achievements

齲蝕原因菌の１つであるStreptococcus mutans（以下ＳＭ）は、バイオフィルムを形成し、その中で様々な環境ストレスに適応して生存し、齲蝕の発症に関わっている。環境適応に際し、遺伝子発現レベルにおいて広範囲な制御が行われ、定常状態を呈していると考えられるが、その方法としてglobal gene regulationを介した遺伝制御に加え、degradosomeと呼ばれるmultiprotein complexの形成やsmall RNAsなどによる制御が行われている可能性がある。これらの関与について明らかにすることを目的とした。E.coliではdegradosome構成タンパクの１つであるenolaseはすでにpull down assay用のconstructの作成を行い、scaffoldとなるRNaseに関してはターゲットとなりそうな遺伝子に関して論文より選択したRNasesJ1,J2のcloningを進めている。また、NrnAのホモログとしのcloningも進めている。
一方、global gene regulatorの探索については、SMによる菌体外多糖である不溶性グルカンの形成ならびに細菌増殖を抑制することで齲蝕抑制が期待されている triterpenoid compounds　（オレアノール酸あるいはウルソール酸など）による環境ストレス下での遺伝子発現の増減の結果から、細菌の伝播・定着に関連の深いgtfsにターゲットを絞り、転写領域を含むコンストラクトを作成し、転写調節に係わる因子の探索の方向からも解析を開始した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

global gene regulatorの探索については、triterpenoid compoundsによる環境ストレス下での変化に焦点を当てて研究を進めており、CovRやRpoE等の関与について明らかしつつあるが、acid-stress, oxidative-stress,　starvation-stress等のストレス状態での探索は進んでいないことから全体的な流れ上、遅れとなっている。

Strategy for Future Research Activity

Degradosome構成タンパク質のenolaseやRNaseを軸にSMでの複合体を形成するタンパク質の探索を行う系を引き続き進め、Degradosomeの形成が行われているかどうかを明らかにする。一方、triterpenoid compoundsによる環境ストレスによる影響についてはすでに報告されているglobal gene に関して、これらによる制御との関連性について確認するとともに、SＭをacid-stress, oxidative-stress, Starvation-stress条件下で培養し、次世代シークエンスを用いて、ストレス時に増減するRNA 発現量を調べると共に関連タンパク質の探索を行い、環境適応に対する細菌内調節機序の一端を明らかにしたい。

Causes of Carryover

環境ストレス下での変化に焦点を当てた実験のうち、CovRやRpoE等の関与について明らかしつつあるが、acid-stress, oxidative-stress,　starvation-stress等のストレス状態での探索が遅れているため，それに係わる試薬等の購入に至らなかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

研究遂行にあたり、本年は遺伝子解析並びにタンパク質発現解析等を行う必要があるが、機器類は教室内並びに中央研究室で使用ができることから機器類の購入を行う予定はなく、薬品・試薬類、抗体などの消耗品費として使用する。