2015 Fiscal Year Research-status Report

細胞イメージングによる歯周病と認知症の関連におけるオートファジー機構解明

Research Project

Project/Area Number	15K15775
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	齋藤俊行長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (10170515)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	林田秀明長崎大学, 病院(歯学系), 講師 (20238140) 古堅麗子長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (90253674)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2017-03-31
Keywords	歯周病 / 認知症 / オートファジー
Outline of Annual Research Achievements	①Aa菌を培養し、培養した細菌を超音波粉砕後、超遠心とプロテアーゼで処理し、凍結乾燥したのち使用する。神経細胞および歯肉線維芽細胞の培養を開始する。 ②１)各種細胞に各種LPSを添加し、経時的に培養上清を回収し、MTT Assay、LDH Assayにより細胞の生存率および増殖率の違いを検証する。２)各種LPS添加後、経時的に回収した細胞からRNAを抽出し、cDNAを合成する。Real-time PCRでTNF-α、IL-6、IL-1等サイトカイン、Adiponectin, resistin, leptin等アディポカインのmRNA量を定量し比較した。３)各種LPSによる刺激後、経時的に回収した培養上清中各種サイトカイン、アディポカインの産生量をELISA法で定量し、各種細胞における濃度依存的および経時的な産生の違いについて解析している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 各種細胞に各種LPSを添加し、経時的に培養上清を回収し、MTT Assay、LDH Assayにより細胞の生存率および増殖率の違いを検証できている。各種LPS添加後、経時的に回収した細胞からRNAを抽出し、cDNAを合成する。Real-time PCRでTNF-α、IL-6、IL-1等サイトカイン、Adiponectin, resistin, leptin等アディポカインのmRNA量を定量し比較することができており、おおむね順調に進んでいる。
Strategy for Future Research Activity	ATG5, ATG7, BECN1などのオートファジー関連因子の抗体を用いた Western blotting 法により発現の違いを解析する。その後 ①イメージングサイトメーターにより、各種サイトカイン、アディポカイン、オートファジー関連因子を発現した細胞と細胞形態に関連があるかどうかを解析する。また、細胞内転写因子局在もあわせて確認する。 ②伝達抑制剤JNK、MAPK各種抗体（SP600125、LY294002、PD98059、SB203580）による処理後に各種LPSを添加後、経時的に回収した培養上清中のTNF-α、IL-6、IL-1等産生量をELISA法にて、また細胞中レベルをWestern blot 、Real-time PCRで各種サイトカイン、各種アディポカインのmRNA量を定量し比較することで、シグナル伝達経路の違いについて解析する ③１）レプチンおよびレプチン受容体siRNAを作成し、神経細胞と歯肉線維芽細胞に遺伝子導入後、MTT Assay、LDH Assayにより細胞の生存率および増殖率の違いを検証する。２）各種LPSで刺激後の各種サイトカイン、アディポカイン産生をELISA法およびWestern blot、Real-time PCRにて比較し、さらに高血糖培養条件でも同様に解析する。
Causes of Carryover	ATG5, ATG7, BECN1などのオートファジー関連因子の抗体を用いた Western blotting 法による発現の違いを解析するまでは、研究を進めることができず、当初予定していた抗体類が未購入であるため。
Expenditure Plan for Carryover Budget	①各種LPS添加後、経時的に回収した細胞をAdiponectin, resistin, leptin等アディポカインおよびATG5, ATG7, BECN1などのオートファジー関連因子の抗体を用いた Western blotting 法により発現の違いを解析する。高血糖培地での培養後の細胞とも比較する。 ②糖尿病モデルにおける各種LPS添加時の解析のため、レプチン遺伝子変異マウスob/obマウスおよびレプチン受容体欠損マウスdb/dbに各種LPSを投与し、マウス用CTを用いて海馬の面積などに違いがあるかどうか検証する。