2015 Fiscal Year Research-status Report
DNA損傷トレランス機構をターゲットとした新規がん分子標的治療の展開基盤
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15K16126
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
櫻井 靖高 北里大学, 医学部, 助教 (50733101)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | DNA損傷トレランス / 損傷乗り越えDNA合成 / DNAポリメラーゼ / DNA複製 / DNA修復 / 薬剤耐性 / 突然変異 / 細胞死 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA損傷トレランスは細胞の損傷ストレス耐性に寄与する機構であるが、DNA複製をターゲットとした抗癌剤の効果に対して抑制的に働いている可能性がある。本研究課題ではシスプラチンのDNA損傷トレランスに関与する分子に着目し、その一つであるREV7の生理的機能の解析を行った。
まず、REV7をターゲットとしたshRNA発現ベクターを細胞にトランスフェクションし、REV7の発現を抑制した細胞を樹立した。また、コントロールとしてshRNA発現ベクターのみをトランスフェクションした細胞を樹立した。発現抑制の効果はウエスタンブロットにて確認を行い、十分な抑制効果の認められたクローンを選定した。続いて、樹立した細胞をシスプラチンで処理し、細胞の応答を解析した。コロニー形成法による感受性試験では、REV7抑制細胞はコントロール細胞よりもシスプラチンに対して高い感受性を示した。また、シスプラチン処理後の細胞から細胞抽出液を調製し、ウエスタンブロット法でタンパク質の挙動を解析したところ、p53やpH2AX、切断型PARPの増加が認められた。さらに、アポトーシスによるDNAの断片化をTUNEL法で調べたところ、REV7を抑制した細胞ではコントロールと比較して、シスプラチン処理によってTUNEL陽性細胞が増加した。これらの結果から、REV7を抑制するとシスプラチンに誘発される二本鎖切断が増加し、細胞死が誘導されることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通りにREV7抑制細胞の樹立に成功し、シスプラチンに対する応答を解析することができた。REV7を抑制することでシスプラチンの効果が増強されることを示せたことから、一定の成果が得られたと考えている。また、次年度以降用いるREV7欠損マウスの戻し交配を計画通り行うことができた。さらに、シスプラチンに長期間暴露することで耐性を獲得した細胞株を樹立することができ、このシスプラチン耐性細胞に関してもREV7の抑制効果を解析中である。現在のところ研究計画通りに研究を進めることができており、達成度はおおむね順調であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞の表現型解析としては、シスプラチン処理後の突然変異頻度の解析を行う予定である。マウス個体の表現型解析としては、REV7抑制細胞をヌードマウスに移植し、シスプラチンによる腫瘍縮小効果を検討する予定である。また、REV7欠損マウスにシスプラチンを投与し、腎機能障害等の副作用や遺伝毒性等を評価する予定である。培養細胞とマウス個体の両面からDNA損傷トレランス機構の分子標的治療法としての有効性を検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
国内旅費を使用しなかった点と遺伝子工学試薬類の購入費が当初予定額より抑えられたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験動物関連と細胞培養関連を中心とした消耗品の補充に充てる予定である。
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