2016 Fiscal Year Research-status Report
DNA相同組換えにおけるDNAクランプの酵素反応制御機構の解明
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15K16128
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| Research Institution | Sojo University |
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Principal Investigator |
河合 聡人 崇城大学, 薬学部, 助教 (20435150)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質の結晶化 / DNA相同組換え / DNAクランプ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA複製や修復時には、様々な酵素が次々と順序良くDNAに作用することで一連の酵素反応が実施されている。ここで、酵素反応の足場となり、円滑な反応を進行させる重要な因子としてDNAクランプの存在が注目されている。本研究は、DNA相同組換え機構において、ホリデイ構造の移動から切断に至る一連の酵素反応が、四量体型DNAクランプによって制御される仕組みを明らかにすることを目的にしている。そして、これらの反応を担当するDNAヘリカーゼ（Hjm） -ホリデイ構造 複合体、リゾルバーゼ（Hjc）-四量体型DNAクランプ -ホリデイ構造 複合体といった超分子複合体についてX線結晶構造解析を用いた立体構造の解明を目指している。本年度は、Hjc - 四量体型DNAクランプ複合体について結晶化条件の最適化に取り組み、得られた結晶を用いて放射光実験施設でのX線回折実験を実施した。結果、昨年度までに得られていた結晶の最大分解能は10 オングストローム程度であったが、本年度は4.3 オングストロームまで改善した。また、Hjc-四量体型DNAクランプ複合体についてSEC-SAXS解析を実施し、濃度依存的な会合状態が存在することを示唆する結果が得られた。Hjmについては精製方法を改良し、昨年度までに観察されていた分解を可能な限り抑えることに成功した。さらにこのサンプルを用いて結晶化条件を検討したところ微結晶が得られるような条件がいくつかみつかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
熊本地震の影響で、研究環境の復旧に時間が必要になったことに加え、それまでに得られていた結晶はすべて割れ、結晶化条件の最適化していたサンプルについても再検討することになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
Hjc-四量体型DNAクランプ複合体、Hjmの結晶化については、現在結晶が得られている条件を基に、より厚みのある結晶が得られるような結晶化条件を探索することに加え、結晶の凍結条件を含めたX線回折実験条件の最適化を進める。さらに現在結晶の得られていないホリデイ構造で超分子複合体についても、DNA鎖の長さを変えながら結晶化条件を探索する。また、Hjc -四量体型DNAクランプ複合体については、実験室系装置を利用してSAXS測定を行い、濃度変化による会合状態変化を確認した後、より詳細な構造情報の取得を目指して放射光を利用したSEC-SAXS測定の実施につなげたい。
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| Causes of Carryover |
熊本地震の影響で実験時間が確保できなかったため
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
タンパク質の結晶化、X線回折実験に必要な消耗品、サンプルの輸送費を主に効率的に使用する。また、昨年度余った分については、条件が定まらず想定以上に消費している結晶化用のシリコン加工されたカバーガラスの購入に充てる予定である。
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