2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of rapid and ultra-sensitive enzyme immunoassay for egg white allergen
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15K16237
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| Research Institution | University of Kochi |
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Principal Investigator |
沼田 聡 高知県立大学, 健康栄養学部, 助教 (10565857)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 酵素免疫測定法 / 食物アレルギー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、卵白アレルゲンに対する迅速な超高感度酵素免疫測定法（ICT-EIA法）を開発することである。
課題となっていたRCM化OVA抗体の精製ついて、RCM化OVA-セファロースを作成することができたが、アフィニティー精製時にRCM化OVAとRCM化OVA抗体が複合体を形成した状態での溶出が多かったことから、コンジュゲートとして使用することが困難であった。
そこで、RCM化していないOVA抗体を用いて補足用コンジュゲートと検出用コンジュゲートを作成し、高感度化および高速化の検討を進めた。高感度化では従来のELISA法と比較した結果、650倍高感度であった。高速化ではICT-EIA法の3箇所の工程で検討を行った。1つ目は抗原と2種のコンジュゲートでの免疫複合体形成の高速化、2つ目は固相に磁気ビーズを用いて免疫複合体補足の高速化、3つ目は酵素反応の高速化である。免疫複合体形成の高速化では、ICT-EIA法の従来の抗原と2種のコンジュゲート濃度では反応に9時間要したが、2種のコンジュゲートを高濃度にすることで、4時間までに短縮することが可能となった。免疫複合体補足の高速化では、従来のICT-EIA法で使用している固相での補足等の操作に90分要していたが、磁気ビーズを使用することで20分まで短縮することができた。酵素反応の高速化では、当初酵素サイクリング法で検討する予定でいたが、高感度で高速化が可能である化学発光法を用いることとした。酵素にはガラクトシダーゼを使用していたため、ガラクトシダーゼに対する化学発光基質を用いた。従来のICT-EIA法（蛍光法）では酵素反応に20時間要するが、化学発光法では1時間で測定が可能となる。しかし、化学発光法を用いたところ、検出感度は従来のICT-EIA法より低く測定レンジも狭くなり、かつ発光も非常に弱いため、さらなる改良が必要である。
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Research Products
(2 results)
