生きている細胞におけるオルガネラ膜上分子アッセンブリーの解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K16562
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 山口 亜利沙 (宮川亜利沙) 高知大学, 医学部, 日本学術振興会 特別研究員 (90553157)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: プロテオミクス / 分子アッセンブリー

Outline of Annual Research Achievements

従来技術では、生きている細胞内で、どのような分子が会合し集合体を形成しているかを解析することができなかったため、本研究では、申請者が独自に開発した「HRP 発現型・高特異性 EMARS 法」を用いて、生細胞のオルガネラ膜上分子アッセンブリーを明らかにすることを目的とし、各種オルガネラ膜上分子アッセンブリー同定法を確立しようとした。
まず、細胞内にてEMARS法が適用可能か否かを解析するため、小胞体、ゴルジあるいは分泌小胞にHRP融合タンパクを発現させ、EMARS反応の条件を検討した。具体的には、小胞体保持シグナルであるKDELをHRPに付加したHRP-KDEL配列、およびゴルジに存在する酵素であるβ1,4- galactosyltransferase1を付加したβ4GALT1-HRP配列、分泌タンパク質であるgalectin3を付加したgalectin3-HRP配列を組み込んだベクターを作製した。これらをHeLa細胞に導入・発現させ、EMARS反応を行った。その結果、発現したHRP-KDELあるいはβ4GALT1-HRPは、小胞体マーカー（calnexin）あるいはゴルジマーカー（GM130）と共局在し、さらにはEMARS反応による標識ラベルであるFluoresceinとも共局在していた。また、細胞内小胞についてもEMARS反応による標識ラベルであるFluoresceinと共局在した。よって、細胞内オルガネラにおいてもEMARS法が適用可能であることが明らかとなった。また、EMARS反応を触媒する酵素について検討した。これまでEMARS反応の触媒酵素としてHRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を使用していたが、HRPは細胞質では活性発現しないので、HRPと同様の酵素活性をもつAPEX（アスコルビン酸ペルオキシダーゼ）の使用を検討した。その結果、APEXによってもEMARS反応が可能であることが確認された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

EMARS反応に必要なHRPをオルガネラに発現させ、EMARS法の条件を検討することにより、各種オルガネラ膜における高特異性EMARS反応の至適化が達成された。これにより、細胞内においてもEMARS法が適用可能であることを明らかにした。さらに、EMARS反応の触媒酵素としてのHRPに加え、APEXも使用可能であることが明らかとなり、より細胞内オルガネラの適用範囲が広がった。

Strategy for Future Research Activity

各種オルガネラにHRPまたはAPEXを発現させた細胞に、チラミド-FITCを添加し、本年度決定した条件にて高特異性 EMARS反応を行う。続いて、抗 FITC 抗体セファロースを用いて精製・濃縮した後、トリプシンにて消化したペプチド断片を LC－MS/MS 質量分析を用いて同定する予定である。

Causes of Carryover

予定していた実験である質量分析・分子同定まで到達しなかったため、分析や機器メンテナンスにかけている費用を使用しなかった。次年度は、本分析に費用をかける予定である。