2015 Fiscal Year Research-status Report
プリオンタンパク質由来フラグメントペプチドを用いたiPS細胞分化神経細胞への影響
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15K17887
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
小嶋 絢 立命館大学, 薬学部, 助教 (10733587)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | プリオンタンパク質C末端由来フラグメントペプチド / 分子内・分子間相互作用 / 凝集性 / アポトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、(1) プリオンタンパク質C末端由来フラグメントペプチド(PrP-F-C)の凝集性への関与と、(2) ヒト神経芽腫細胞と神経グリア細胞を用いたプリオンタンパク質由来フラグメントペプチドの添加とその銅イオンの影響について検討した。
(1) では、申請者はプリオンタンパク質の凝集には引き金になる構造変化があることを仮定してきた。これまで行ってきたフラグメントペプチドを用いた検討の中で特にPrP-F-Cが構造変化や凝集性が強いことを示唆する結果が得られていた。このことから、凝集には分子内・分子間相互作用が必ず関与すると考えられることからC末端側のペプチドを合成し測定を試みた。その結果、プリオンタンパク質180-192残基に該当するペプチド(PrP180-192)がPrP175-189と分子間相互作用することが確認された。その他、PrP169-183、PrP175-183とも結合する可能性を示唆する結果が得られ、今後繊維化・凝集性も含め詳細に検討していく。
(2)では、実際用いたいと考えているESやiPS細胞由来神経幹細胞・神経細胞を用いる前に、神経芽腫細胞と神経グリア細胞を用いてアポトーシス検出の条件検討を行った。各細胞を播種後24時間後にペプチドを添加し、曝露時間、添加量、回収方法、抽出方法について検討した。アポトーシスの誘導対照としてはエトポシドを用いて抗カスパーゼ3抗体を用いてウェスタンブロッティングにより検出した。その結果、添加量は既知の報告の通り20uMが妥当であると考えられたが凝集性の高いペプチドは溶媒に用いているジメチルスルホキシドに溶解しないものもありもう少し検討する必要がある。曝露時間は48時間が良い結果が得られたためもう少し長時間の検討も進める。検討条件を早めに確定することで確実な結果が得られるようにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はアポトーシスの検出条件を決定することを目的としていた。また、それと並行してこれまで行ってきた凝集メカニズムの解明に関しても進める計画をしていた。
検討に用いるプリオンタンパク質C末端由来フラグメントペプチド(PrP-C-F)は問題なく目的分子量のものが合成し、単離・精製できた。また、添加実験ではまだ曝露時間や濃度を確定には至っていないがアポトーシスを誘導するPrP-C-Fの候補を見つけることができた。しかし、再現性は見られるものの細胞自体の大きさによって必要とする細胞数またはタンパク質量による影響があると考えられる結果をえている。従って、現在の条件が最適な条件であるとは言い難い。そのため条件を確定してからESまたはiPS由来神経幹細胞を用いた検討をすべきと考えている。先立って始めた銅イオンによるアポトーシスの濃度依存的に関しても予定していた濃度ではやはりアポトーシスを起こしてしまうため、PrP-C-Fの添加濃度に合わせて並行して検討する必要がある。
凝集性メカニズムの解明では、PrP-C-F の分子内・分子間相互作用を確認できた。特に今回アポトーシス誘導の候補となると考えれたPrP--C-Fには強い相互作用が見られたことからアポトーシス誘導と関連づけられると考えている。こちらに関してもより詳細に検討していく。
以上のことから、当初の計画通りに進められてはいるものの、やはり条件検討に時間がかかっているため迅速に条件を決定する必要があると考え遂行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
検出条件を決める上で一番の問題は、計画当初から考えていた銅イオン自身の影響によるアポトーシスの誘導である。よって、計画していた濃度よりも低濃度添加条件での影響をまず検討する。これまで、十分量であると考えていたPrP-C-Fに含まれるHisの2等量の銅イオンを添加したが添加するペプチド濃度が高いため銅イオンの濃度も出やすくなる。したがって、二次構造変化の見られたPrP-C-Fを用いて銅イオンの添加量を変えその変化がどの濃度まで見られるかを確認する。また、凝集性のペプチドを用いることから溶媒であるDMSOに溶解してもすぐに白濁してしまう試料があるため、これに関してもアポトーシスの誘導候補であるPrP-C-Fの添加量を変えて、誘導限界を確認する。これら二点を迅速に行い、さらには曝露時間を最小濃度で検討することで検出条件は確定できると考える。
また、上記の検討に並行して計画内にあるPrP-C-Fを蛍光標識し相互作用局在を明らかとしてくことで凝集メカニズムの解明についても進めていく。これにより経過時間の無駄がないように計画を進めていく。
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