2016 Fiscal Year Annual Research Report
Identification of ribozyme catalyzes DNA methylation to develop gene specific DNA methylation system
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15K18278
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| Research Institution | Tokyo University of Technology |
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Principal Investigator |
吉田 亘 東京工科大学, 応用生物学部, 助教 (10599806)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | リボザイム / DNAメチル化 / in vitro selection |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はDNAメチル化反応を触媒する機能性RNAであるリボザイムを同定し、それを用いてヒトゲノム中の標的領域を特異的にメチル化するRNAを作製することを目的としている。生体内ではDNAメチル化反応はDNAメチル化酵素によって触媒されており、そのメチル基のドナーはS-アデノシルメチオニン(SAM)である。また、SAMに結合するRNAが既に同定されていることから、このRNAのSAM結合領域以外をランダム化したライブラリーを用いれば、DNAメチル化反応を触媒するリボザイムを同定できると考えた。そこで、SAM結合領域以外をランダム化したRNAライブラリーを合成し、メチル化の標的となるCG配列を含む二本鎖DNAをランダムRNAライブラリーに連結したライブラリーを作製した。メチル化反応を触媒するRNAは連結した二本鎖DNAのCG配列をメチル化するため、メチル化感受性制限酵素を用いれば、メチル化反応を触媒したRNAのみ回収できると考えた。これまではメチル化されるとDNAを切断しない制限酵素HapIIを用い、切断されなかったライブラリーをNative PAGEにより分離し、スクリーニングに用いた。しかし、ラウンドを重ねても目的のRNAライブラリーを濃縮することが出来なかった。そこで、本年度はメチル化されているとDNAを切断するMspJ Iを用い、切断されたライブラリーの分離を磁性ビーズにより行った。4ラウンドのスクリーニングの結果、ラウンドを重ねるごとにライブラリーの濃縮が確認された。つまり、この濃縮されたライブラリー中に目的のDNAメチル化反応を触媒するRNAが含まれることが示唆された。また、DNA四重鎖がメチル化されることによりその構造が安定化することを発見し、これを利用したメチル化DNA検出法の開発にも成功した。
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Research Products
(4 results)
