2016 Fiscal Year Research-status Report

新規オリゴデンドロサイト運命決定因子の探索と発生・再生への作用の解析

Research Project

Project/Area Number	15K18371
Research Institution	Gunma University
Principal Investigator	成瀬雅衣群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (60455219)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	オリゴデンドロサイト / 神経幹細胞 / 小脳 / 発生 / 脱髄
Outline of Annual Research Achievements	神経幹細胞からオリゴデンドロサイトへの分化決定メカニズムは未だ未解明な点が多い。大脳では出生前にほとんどの細胞運命が決定されるが、小脳では出生後も白質に神経幹細胞が残り、これからもニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトが産生される事が示唆されているが、その分化制御機構はまったく未解明である。我々はこれまでに生後発達期の小脳神経幹細胞の分化能は経時的に変化する事を明らかにした。発達期小脳のオリゴデンドロサイトへ分化能が高い培養神経幹細胞（生後3日目より調製）とほとんどオリゴデンドロサイトへ分化しない培養神経幹細胞（生後8日目より調製）の遺伝子発現をDNAマイクロアレイにより網羅的に解析し、神経幹細胞からオリゴデンドロサイト産生を誘導する候補因子を探索した。今年度はDNAマイクロアレイ解析の結果をもとに、網羅的に得られた候補因子の発現量をreal time PCRにより定量し、in situ hybridization法により発達期小脳組織での経時的発現変化を解析した。定量的real time PCRにより、4つの新規転写因子が生後3日目の小脳より調製したオリゴデンドロサイトへの分化能が高い神経幹細胞に高発現している事を明らかにした。そのうちの２つの新規転写因子が生後3日齢小脳では多数の小脳前駆細胞に発現し、生後8日齢の小脳白質にはほとんど発現していない事を示した。今後はこの２つの候補遺伝子の神経幹細胞の分化制御に関する機能を解析する。また、脳梁で局所脱髄が誘導されると脳室下層の神経幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞が産生される。脱髄により活性化したミクログリアが脳室下層の神経幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞を誘導する事を脳梁へのリソレクチン投与による脱髄誘導とミノサイクリン投与によるミクログリアの活性化抑制により明らかにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 研究業績に示したように、DNAマイクロアレイ解析によって得られた網羅的な遺伝子群の発現変動データから、発現解析と定量解析により神経幹細胞の分化制御をおこなう候補因子を2つにまで絞り込む事ができた。しかし、候補遺伝子の絞り込みに時間がかかり、発達期と脱髄損傷時の神経幹細胞分化に対する機能解析まで完了する事ができなかった。
Strategy for Future Research Activity	神経幹細胞の培養をもちいて、得られた2つの候補遺伝子の強制発現、ノックダウンをおこない、神経幹細胞のオリゴデンドロサイトへの分化を制御するか機能解析をおこなう。in vitro解析により、神経幹細胞の運命決定を制御する事が示唆されたら、ウイルスを作製し、in vivoで遺伝子の過剰発現、ノックダウンをおこない、神経幹細胞の分化をin vivoでも制御しているか解析する。また、脱髄、髄鞘再生時における神経幹細胞の性質変化を解析する実験系を初年度に確立したので、それをもとに、髄鞘再生時における神経幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞への運命決定制御システムを、脱髄疾患モデルマウスを利用し、組織学的解析や阻害剤を用いた機能解析により解析する。
Causes of Carryover	DNAマイクロアレイ解析によって得られた網羅的な遺伝子群の発現変動データをもとに、発現解析と定量解析により神経幹細胞からオリゴデンドロサイト分化を誘導する候補因子を2つに絞り込む事ができた。しかし、候補因子の絞り込みに時間がかかり、計画の通りに発達期と脱髄損傷時の神経幹細胞分化に対する機能解析まで完了する事ができなかった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	神経幹細胞の培養をもちいて、2つの候補遺伝子の強制発現、ノックダウンをおこない、神経幹細胞のオリゴデンドロサイトへの分化を制御するか機能解析をおこなう。in vitro解析により、神経幹細胞の運命を制御する事が示唆されたら、ウイルスを作製し、in vivoで遺伝子の過剰発現、ノックダウンをおこない、神経幹細胞の分化制御をin vivoで解析する。また、脱髄、髄鞘再生時における神経幹細胞の性質変化を解析する実験系を初年度に確立したので、それをもとに、髄鞘再生時における神経幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞への運命決定制御システムを、脱髄疾患モデルマウスを利用し、組織学的解析や阻害剤を用いた機能解析により解析する。