ヒトGPCRであるドパミンD2受容体のX線結晶構造解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K18376
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 林 到ヒョン 京都大学, 医学研究科, 特定研究員 (50721883)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: X線結晶構造解析 / GPCR / 膜タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

平成28年度に予定されている研究計画では、前年度の研究で確立したDRD2の発現・精製系を用いて、高純度のタンパク質を大量に生産した後、結晶化を行うことでDRD2の結晶を創出することであった。各種の安定化変異の導入や構造的フレキシビリティが高い細胞内第3ループをアポ型チドクロームB562 の変異体(bRIL)等に置換することで安定性が向上したDRD2を得ることができたが、その結晶を作り出すことには至らなかった。そこで、DRD2の結晶化効率を向上するために、DRD2の3次元構造を特異的に認識する抗体の生産を試みた。抗体の作製は、マウスを用いたハイブリドーマ法にて行われた。マウスから作られた様々な抗体のうち、DRD2の3次元構造のみを認識する抗体を選別する為に、3段階の精密なスクリーニング過程を経て、最終的に3種類のDRD2構造認識抗体を得ることができた。得られた抗体を大量に生産・精製し、抗体のFab断片を調整した後にDRD2に結合させて結晶化を行なった。その結果、いくつかの良質な結晶を得ることに成功した。これからは、これらの結晶においてタンパク質の結晶であることを評価した後、大型放射光施設(SPring-8)及びX線自由電子レーザー(XFEL)施設(SACLA)で回折像を評価する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当該年度において、達成すべき内容はDRD2の結晶を創出し、構造を決定して構造解析を行うことであった。前年度の研究により作製された10種類以上のDRD2安定化変異体を用いて結晶化を試みたが、有意な結晶を得ることはできなかった。そこで、DRD2の3次元構造を特異的に認識する抗体の製作を試みた。膜タンパク質の結晶化において抗体フラグメントは、親水性表面に特異的に結合することにより親水性領域を多くし、結晶の形成を助ける役割をする。DRD2に特異的に結合する抗体を生産し、結晶化に用いることができれば、結晶が得られる可能性が高くなると考えられる。精製したDRD2をマウスに注射することで免疫応答を起こし、抗血清価の上昇したマウスから脾臓細胞を摘出し、ミエローマ細胞と融合することで抗体産生ハイブリドーマを樹立した。DRD2の3次元構造を特異的に認識する抗体のみを選別する為に、融合細胞サブクローンの約1000株に対し、3段階のスクリーニング(リポソームELISA、変性ELISA、FSECなど)を行なって最終的に3種類のDRD2構造認識抗体の取得に成功した。これらの抗体は、DRD2と結合し複合体を形成することで、それぞれ1~5度の熱安定性を向上させる効果がある機能性抗体であることが明らかになった。得られた抗体を大量に生産し、精製することで、100 mLの培養で約3.3 mgの抗体Fab断片の精製標品を得ることができた。このFab断片とDRD2を結合させてDRD2-Fab複合体の結晶化を行なった。いくつかの結晶化条件からタンパク質の結晶と予測される結晶を創出することができた。これらの点においては当該年度の研究目的を少しは達成していると思われる。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究方針としては、まずは取得したDRD2-Fab複合体の結晶について、実験室系のX線装置(Rigaku R-axis IV++)を用いてタンパク質結晶であることを確認する。タンパク質の結晶が確認できたら、大型放射光施設 (SPring-8)のマイクロフォーカスビーム(BL32XU)及びX線自由電子レーザー(XFEL)施設(SACLA)で回折像の評価を行う。構造解析可能なX線回折を示す結晶が得られれば、データを収集し、構造決定を行う予定である。以上が現状における本年度の基本的な推進方針である。しかしながら、構造解析に成功する為には、回折像の分解能制限を克服する必要がある。その為には、結晶の種類の確保かつ良質な結晶をたくさん確保する必要がある。そこで、現在得られている結晶の結晶化条件を中心に最適化を行い、結晶の質(大きさと形)を上げると共に、その量を確保するなどの対策を整えておく。これら様々な可能性を考慮した上本年度の推進方針を決定する予定である。

Causes of Carryover

動物細胞におけるDRD2の大量生産には非常に高価な培地が大量に必要である。またDRD2の抗体を製作する為には、マウスを使った動物実験や抗体スクリーニングなどに高価な物品が使われる。しかしながら、発現・精製法を改良によりその発現量が3倍以上向上したことや、1回の抗体作製で良好な抗体を取得できたことから物品費の次年度使用額が生じた。また放射光施設での回折実験を行う為には、複数回の出張が必要である。その為に、旅費としての予算を多めに計上していた。しかし、結晶の創出が年度末であった為、年度中の放射光実験ができなかったことが次年度使用額が生じた理由である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度には主にDRD2の結晶化及び放射光実験を行う予定のため、結晶化キット及びその他の物品や旅費などを使用する予定である。また、構造決定後には、その薬剤選択制を調べる必要がある為、高価の放射線標識リガンドを用いた実験を行う予定である。