2015 Fiscal Year Research-status Report
Y-family DNAポリメラーゼ阻害によるc-myc高発現がん治療基盤の確立
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15K18438
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
倉島 公憲 群馬大学, 生体調節研究所, 研究員 (90724956)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 複製ストレス / c-MYC / y-family polymerase / Polη |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん遺伝子の活性化はDNA複製の異常とそれに伴うDNA損傷を生じさせる。この複製ストレスの増強による腫瘍特異的な殺細胞効果が注目されているが、この応答の詳細な分子機構、特にどのようなDNAポリメラーゼが関与するかは明らかでない。そこで複製忠実度は低いが損傷を乗り越えて複製する事ができるY-family DNAポリメラーゼ（Y-Pol）に注目し、解析を行った。がん遺伝子c-MYC活性化細胞において、Y-PolであるPolη、Polι、Polκ、REV1、複製ポリメラーゼであるPolδ、Polεに対するsiRNAによる発現抑制の効果をみた結果、Polηの発現抑制が相乗的に細胞増殖阻害と細胞死を誘導した。また、この時γH2AXによる免疫染色およびニュートラルコメットアッセイによりDNA二本鎖切断（DSB）が生じている事が明らかとなった。DNA fiber法を用いて複製ダイナミクスをみた結果、c－MYC活性化による複製フォークの進行速度の低下と停止がPolη発現抑制により、さらに増加していた。複製停止部位で機能する事が知られている構造特異的ヌクレアーゼMUS81の発現抑制によりc-MYC活性化とPolη発現抑制によるDSB生成が抑制された。以上の結果はPolηがc-MYC活性化による複製フォークの停止を軽減しており、Polηの機能阻害により、複製フォークの停止→MUS81によるDSB生成→ゲノム不安定性・細胞死を引き起こす事を示唆する。このようにc-MYC活性化による複製ストレスとPolηの機能阻害による合成致死効果がc-MYC高発現がん治療の新たな道を開く可能性が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
4OHTの添加によりc-MYCの活性化が誘導可能な細胞株（U2OS/c-MYC-ER）を用いて、ほぼ計画通りに以下のことを明らかにしたことから、おおむね順調に進展していると評価した。
Y-family PolymeraseであるPolη、Polι、Polκ、REV1および複製ポリメラーゼであるPolε、Polδの発現抑制をsiRNAにより行った結果、Polηの発現抑制とc-MYCの活性化により、顕著に細胞増殖の低下と細胞死の亢進が認められた。このとき、DNA二本鎖切断が構造特異的ヌクレアーゼMUS81依存的に生じていた。
細胞内で合成されるDNAをIdU、CldUで連続してパルス標識することで1分子ごとの複製ダイナミクスを解析可能なDNA fiber法により、Polηの発現抑制がc-MYC活性化による複製速度の低下や複製フォークの停止を促進させた。
以上のことよりPolηがc-MYC活性化により誘導される複製フォークの停止を抑制しており、Polηの機能阻害により、複製フォークの停止→MUS81によるDSB生成→ゲノム不安定性・細胞死を引き起こす事が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画通り、c-MYCによる複製ストレス応答においてPolηや他のY-Polメンバー、関連因子のより詳細な機能の解析に加え、他の複製ストレス応答機構との比較、また、異なる細胞系やがん遺伝子における検討を行う。
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| Causes of Carryover |
当初の予定ではDNA combing法を行う予定であったが、代替法であるDNA fiber法を用いて充分な結果が得られたため今年度はDNA combing法に必要な試薬や器具を購入しなかった。次年度においてDNA combing法を行う際に購入する予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細胞培養に必要な培地や器具、生化学、分子生物学実験に必要な抗体や試薬を中心に消耗品に使用する。また、学会出張や論文原稿の英文校正に使用する予定である。
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Research Products
(6 results)
