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2015 Fiscal Year Research-status Report

脱ユビキチン化酵素CYLDの特異的阻害剤の開発とケミカルプローブとしての応用

Research Project

Project/Area Number 15K18468
Research InstitutionEhime University

Principal Investigator

高橋 宏隆  愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 助教 (70432804)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2017-03-31
KeywordsCYLD / 脱ユビキチン化酵素 / NF-κB活性化経路 / ケミカルプローブ / ユビキチン
Outline of Annual Research Achievements

先行研究により、コムギ無細胞系を用いて作製した完全長のCYLD組換えタンパク質を用いて、ポリユビキチン鎖切断(poly-Ub鎖)をAlphaScreen法によってハイスループットかつ高感度に検出する1次スクリーニングを行い、9,600種類の化合物ライブラリーより、CYLDの直鎖型ポリユビキチン鎖に対するDUB活性を阻害する8種類のヒット化合物を見出していた。
本申請研究においては、選抜された8種類について、より詳細な阻害効果や基質となるpoly-Ub鎖の特異性、さらにCYLD以外のDUBへの阻害効果について調べることで、CYLDのDUB活性を特異的に阻害する化合物を生化学的手法により同定する高次解析を行った。当初CYLDのDUB活性を検出する高次解析ではウェスタンブロット法を予定していたが、より安定的かつ定量的にDUB活性を検出可能なRuby染色法によるアッセイの構築に成功した。このアッセイ系により、阻害効果が高かった化合物2種類(化合物Aおよび化合物B)を見出した。化合物AおよびBはその構造にほとんど類似点がなく、異なった作用機序を持つものと期待され、以降はこの2つについてさらに詳細な解析を行った。CYLDはUSPと呼ばれるセリンプロテアーゼ型のDUBファミリーに属しているが、化合物Aはファミリーに依存せず、多くのDUBの活性を阻害したが、化合物BはUSPファミリーのみDUB活性を抑制した。
さらに、化合物AおよびBはヒト培養細胞においてNF-κB活性を上昇させることが明らかとなった。細胞毒性試験より、化合物Aは10 µM程度で細胞に毒性を示すものの、化合物Bは同濃度ではほとんど影響を及ぼさなかった。これらのことから、化合物Bは細胞内においてNF-κBの負の制御因子であるCYLDを機能阻害することで、NF-κBを正に制御している可能性が強く示唆され、ケミカルプローブとしての応用が期待される。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

27年度は、ヒット化合物候補8種類の中から阻害効果の高い化合物を選抜し、それらのCYLDへの作用機構について生化学的解析を用いて明らかにすることを予定していた。その結果、CYLDの活性を顕著に阻害する化合物2種類を同定し、それらのポリユビキチン鎖特異性や、他のDUBに対する阻害効果についても明らかとした。これらのことから、27年度に計画していた研究はほぼ終了し、有望なヒット化合物を得るに至っている。さらに28年度に予定していた培養細胞を用いた実験の一部についても既に着手しており、特に化合物Bは細胞毒性が低く、細胞内においてNF-κB活性を増加させることから、非常に有望な化合物であると考えられる。
以上の結果から、当初の計画以上に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

化合物AおよびBについて、培養細胞を用いたNF-κB経路への影響について更に詳細な解析を行う。27年度にこれらの化合物がNF-kB経路を活性化することを予備実験的に明らかにしているが、28年度は化合物が細胞内でCYLDの脱ユビキチン化酵素活性を抑制することでNF-κB活性を上昇させていることを分子レベルで検証する。さらに、CYLDはNF-κB経路以外にもインターフェロン(IFN)誘導を抑制する因子であることから、これらの化合物がIFN誘導経路に作用するか否かについて明らかとする。
また化合物AはCYLD以外のDUBの活性も阻害することや細胞毒性を示すこと、化合物BについてもUSPファミリーに属する他のDUBに作用することから、化合物の構造を改変した類縁体化合物を用いて、特異性の向上および細胞毒性の低下を目指す。

  • Research Products

    (7 results)

All 2016 2015

All Journal Article (2 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (4 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Characterization of RyDEN (C19orf66) as an interferon-stimulated cellular inhibitor against dengue virus replication.2016

    • Author(s)
      Suzuki Y, Chin WX, Han Q, Ichiyama K, Lee CH, Eyo ZW, Ebina H, Takahashi H, Takahashi C, Tan BH, Hishiki T, Ohba K, Matsuyama T, Koyanagi Y, Tan YJ, Sawasaki T, Chu1 JJ, Vasudevan SG, Sano K, Yamamoto N.
    • Journal Title

      PLoS Pathogen

      Volume: 12 Pages: e1005357

    • DOI

      10.1186/s12870-015-0660-9

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Wheat germ-based protein libraries for the functional characterisation of the Arabidopsis E2 ubiquitin conjugating enzymes and the RING-type E3 ubiquitin ligase enzymes.2015

    • Author(s)
      Ramadan A, Nemoto K, Seki M, Shinozaki K, Takahashi H, Sawasaki T.
    • Journal Title

      BMC plant biology

      Volume: 15 Pages: 275

    • DOI

      10.1186/s12870-015-0660-9

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Establishment of deubiquitinating enzyme (DUB) protein array based on wheat cell-free system for a novel biochemical tool.2016

    • Author(s)
      Takahashi H, Doi K, Yamanaka S, Kuwada S, Goto E, Tokunaga F, Sawasaki T.
    • Organizer
      Ubiquitin signaling joint with the meeting on NF-kB and MAP kinase signaling in inflammation, Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology
    • Place of Presentation
      Whistler, British Columbia, Canada
    • Year and Date
      2016-03-13 – 2016-03-17
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] コムギ無細胞系を用いた287種類のヒトとマウスからなるE3ユビキチンリガーゼプロテインアレイの作製と生化学的解析への応用2015

    • Author(s)
      高橋 宏隆, 中島 達朗, 今村 芽依, 高橋 千佳子, 澤崎 達也
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会, 第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      神戸ポートピアホテルおよび神戸国際会議場他, 兵庫県神戸市中央区港島中町
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [Presentation] Regulation of the stability of dengue virus non-structural protein 4B by ubiquitin-proteasome pathway.2015

    • Author(s)
      Takahashi H, Suzuki Y, Vasudevan SG, Sawasaki T, Yamamoto N.
    • Organizer
      第63回ウイルス学会学術集会
    • Place of Presentation
      福岡国際会議場, 福岡県福岡市博多区石城町
    • Year and Date
      2015-11-22 – 2015-11-24
  • [Presentation] Identification of novel E3 ligase that degrades HCV nonstructural protein 4B and inhibits viral replication in Huh7.5.1 cells using wheat cell-free protein production system.2015

    • Author(s)
      Takahashi H, Imamura M, Takeda H, Ito M, Suzuki T, Wakita T, Sawasaki T
    • Organizer
      22nd International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
    • Place of Presentation
      Strasbourg, France
    • Year and Date
      2015-10-09 – 2015-10-13
    • Int'l Joint Research
  • [Book] Technology of wheat cell-free based protein array for biochemical analyses of protein kinases and ubiquitin E3 ligases. in Protein Modifications in Pathogenic Dysregulation of Signaling.2015

    • Author(s)
      Takahashi H, Nemoto K, Ramadan A, Sawasaki T
    • Total Pages
      18
    • Publisher
      Springer Japan

URL: 

Published: 2017-01-06  

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