Development of specific inhibitors targeting a deubiquitinating enzyme CYLD and application of these inhibitors for chemical probe.

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K18468
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 高橋 宏隆 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 講師 (70432804)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 脱ユビキチン化酵素 / CYLD / NF-κB経路 / 低分子化合物スクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

本申請研究は、NF-κB活性化経路において、機能重複しているCYLD, OTULIN, A20の３つの脱ユビキチン化酵素（DUB）の中で、CYLDの果たす役割を解明する目的で、CYLDの活性に特異的な低分子阻害剤の開発を目指した。
平成27年度は、組換えCYLDの直鎖テトラユビキチン鎖（M1Ub4）の切断を、AlphaScreen法によって簡便かつ迅速に検出するアッセイ系を構築し、このアッセイ系を用いて、東京大学創薬機構より分与頂いた9,600化合物より２種類のヒット化合物を得ている。
平成28年度は、この２種類の化合物のうち、より特異性が高く、かつ細胞毒性が低い化合物をその化学構造からSubquinocinと命名し、更に詳細な解析を行った。Subquinocinはin vitroにおいてCYLDと同じファミリーに属するUSP5およびUSP15の活性を有意に阻害したが、異なるファミリーであるOTULINは阻害しなかった。またin vitroでの詳細な解析から、SubquinocinはCYLDとM1Ub4の結合は阻害しない一方で、CYLDの活性部位を阻害していることが明らかとなった。
さらに培養細胞を用いた解析から、SubquinocinがNF-κBの活性化を有意に上昇させること、TNFα刺激依存的に形成されるRIPのポリユビキチン鎖量を増大させることも明らかとなった。これらの現象はCYLDノックアウト細胞では認められないことから、SubquinocinはNF-κB活性化経路において、主にCYLDの活性を阻害することで同経路のネガティブフィードバック機構を減弱させ、結果として活性化へと導いている可能性が強く示唆された。今後、Subquinocinの詳細な結合部位をin silicoドッキングプログラムと生化学的解析を用いて明らかとする。

Research Products

• [Journal Article] HTLV-1 Tax induces formation of the active macromolecular IKK complex by generating lys63- and met1-linked hybrid polyubiquitin chains. (2017)
  • Author(s): Shibata Y, Tokunaga F, Komatsu G, Gohda J, Saeki Y, Tanaka K, Takahashi H, Sawasaki T, Inoue S, Oshiumi H, Seya T, Nakano H, Tanaka Y, Iwai K, Inoue JI.
  • Journal Title: PLoS Pathogen Volume: 13 Pages: e1006162
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1006162.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Dysregulation of a potassium channel, THIK-1, targeted by caspase-8 accelerates cell shrinkage. (2016)
  • Author(s): Sakamaki K, Ishii TM, Sakata T, Takemoto K, Takagi C, Takeuchi A, Morishita R, Takahashi H, Nozawa A, Shinoda H, Chiba K, Sugimoto H, Saito A, Tamate S, Satou Y, Jung SK, Matsuoka S, Koyamada K, Sawasaki T, Nagai T, Ueno N.
  • Journal Title: Biochim Biophys Acta Volume: 1863 Pages: 2766-2783
  • DOI: 10.1016/j.bbamcr.2016.08.010.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Linear ubiquitination is involved in the pathogenesis of optineurin-associated amyotrophic lateral sclerosis. (2016)
  • Author(s): Nakazawa S, Oikawa D, Ishii R, Ayaki T, Takahashi H, Takeda H, Ishitani R, Kamei K, Takeyoshi I, Kawakami H, Iwai K, Hatada I, Sawasaki T, Ito H, Nureki O, Tokunaga F.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 7 Pages: 12547
  • DOI: 10.1038/ncomms12547.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Genome-wide enhancer analysis of the requirement of Six1 and Six4 homeoproteins for Myod reprogramming. (2016)
  • Author(s): Santolini M, Sakakibara I, Gauthier M, Takahashi H, Sawasaki T, Mouly V, Concordet, JP, Defossez PA, Hakim V, Maire P.
  • Journal Title: Nucleic Acids Research Volume: 44 Pages: 8621-8640
  • DOI: 10.1093/nar/gkw512
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 of human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. (2016)
  • Author(s): Takahashi H, Uematsu A, Yamanaka S, Imamura M, Nakajima T, Doi K, Yasuoka S, Takahashi C, Takeda H, Sawasaki T.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 11 Pages: e0156718
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0156718
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] AGIA tag system based on a high affinity rabbit monoclonal antibody against human dopamine receptor D1 for protein analysis. (2016)
  • Author(s): Yano T, Takeda H, Uematsu A, Yamanaka S, Nomura S, Nemoto K, Iwasaki T, Takahashi H, Sawasaki T
  • Journal Title: PLoS One Volume: 11 Pages: e0156716
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0156716
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] コムギ無細胞タンパク質アレイ解析によって見出された、NF-kB活性を抑制する新規DUBの機能解析 (2016)
  • Author(s): 高橋 宏隆, 桒田 翔平, 後藤 栄治, 徳永 文稔, 澤崎 達也
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-12-02
• [Presentation] Regulation of the stability of Dengue virus non-structural protein 4B by ubiquitin-proteasome pathway. (2016)
  • Author(s): Takahashi H, Sameshima Y, Vasudevan SG, Suzuki Y, Yamamoto N. Sawasaki T.
  • Organizer: 23th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses.
  • Place of Presentation: 京都国際会議場（京都府京都市）
  • Year and Date: 2016-10-12
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] コムギ無細胞系を基盤としたプロテインアレイ技術の開発と応用 (2016)
  • Author(s): 高橋 宏隆
  • Organizer: AMED-創薬等支援技術基盤プラットフォーム解析拠点-領域間技術交流会
  • Place of Presentation: 名古屋大学・創薬科学研究館（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2016-09-12
  • Invited
• [Presentation] コムギ無細胞タンパク質合成系を用いたフラビウイルス タンパク質の宿主相互作用タンパク質の探索 (2016)
  • Author(s): 高橋宏隆
  • Organizer: 関西ウイルスクラブ
  • Place of Presentation: 大阪大学微生物病研究所（大阪府吹田市）
  • Year and Date: 2016-07-30
  • Invited
• [Book] Cellular control pf dengue virus replication: Role of interferon-inducible genes. in Dengue (2017)
  • Author(s): Takahashi H, Suzuki Y
  • Total Pages: 23
  • Publisher: InTech