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2016 Fiscal Year Research-status Report

配偶核にて発見した新奇な「ゲノムの切断と修復」の機構と機能の解明

Research Project

Project/Area Number 15K18475
Research InstitutionTohoku University

Principal Investigator

福田 康弘  東北大学, 農学研究科, 助教 (50527794)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
Keywordsリプログラミング / DSB 修復 / Topoisomerase2 / Histone acetylation / 有性生殖 / 配偶子形成
Outline of Annual Research Achievements

テトラヒメナは繊毛虫類に属する単細胞の原生生物であるが,単一の細胞質内に体細胞系列である大核と生殖核である小核を分化させている.小核は有性生殖(接合)が始まると減数分裂を行って,4つの半数体核が作られる.そのうち1核が選択されて配偶核へと発達し,残りの3核はオートファジーにより除去される.これまで4つの半数体核にγH2AXが出現すること、その後1核からγH2AXが消失し、この核が配偶核として選択されることを報告している.γH2AX形成はDNA二重鎖切断(DSB)のエピジェネティクス指標であるため,DSBとDNA修復が配偶核形成において重要であることが示唆される.一般的にDSB近傍のクロマチンはDNAの再結合に伴って更新されるが,DSBが修復された配偶核では新生クロマチンタンパク質の蓄積を示すエピジェネティクス指標が現れる.この配偶核の形成において示唆されたDSBとDNA修復について,我々は一過性のDSBを介した配偶核クロマチンによるゲノムの初期化(リプログラミング)であると仮説をたて,半数体核DSBに関わる分子メカニズムの解明と仮説の妥当性の検証を本研究で進めている.2016年度の研究では,gH2AXの示唆するDSBが半数体核ゲノムを切断している直接的証拠を捕らえ,ゲノムは2.5 Mbp程度に断片化されていること,さらにDSB導入に小核局在性トポイソメレース(TOP2G)などが中心的役割を果たしていることを明らかにした.DNA修復を受けた配偶核におけるエピジェネティクス指標の変化を解析したところ,脱分化した細胞で広く観察されるヒストンH3の高アセチル化が起こることを捕らえた.これら得られたの結果は,テトラヒメナの配偶核形成における分子メカニズムの知見を深め,我々の仮説「一過性のDSBを介したクロマチン再編成による配偶核ゲノムのリプログラミング」を更に支持するものであった.

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は,配偶核ゲノムの切断と修復を行っている分子機構の解明,および切断と修復にともなう配偶核のゲノム構造の変化の解明するため,三つの研究課題に取り組んでいる.2016 年度における成果は,DSB の直接的証明,DSB で切断されたゲノムサイズの解明,DSB 実行因子 TOP2G の同定,そしてヒストンの高アセチル化の発見であった.これらは課題 2(配偶核ゲノムの切断と修復に関連する遺伝子の機能を解析)および課題 3(切断と修復が引き起こす配偶核ゲノムのエピジェネティック修飾の変化)に関するもので,本研究の進展レベルを研究開始当初に掲げた目標へ大きく近づけた.これらの成果を専門分野の第三者が多く参加する分子生物学会年会で発表したところ,高い評価を受けて優秀ポスター賞を受賞した.これらの点から,本研究が概ね順調に進展していると判断した.

Strategy for Future Research Activity

既にTOP2Gが小核ゲノムを切断するDSB(DNA二重鎖切断)の実行因子であることが明らかにした.2017年度は,両DNA切断酵素から構成される DSB 実行因子複合体の構造,DSB実行因子複合体が切断する小核ゲノム上の位置を明らかにすること,DSBが修復された配偶核のエピジェネティクスな変化の詳細を明らかにすることを課題として進める.
1)DSB実行因子複合体の解析:タグを融合したTOP2Gを発現する組み換え体を既に作出した.これらタグ TOP2Gを用いた融合免疫沈降法を行い,DSB実行因子複合体を細胞内から精製する.精製されたDSB実行因子複合体の構成タンパク質をPAGEで分離し,構成分子それぞれをMALDI-TOF/TOFやLC/MS/MSで同定する.本課題では,研究代表者が免疫沈降条件を検討し,その条件に基づいて海外共同研究者が質量解析を行う.
2)DSB切断部位の解明とアノテーション:TOP2Gによって導入されたDSBが小核ゲノムを1.5-3.5 Mbp程度へ断片化することを既に明らかにしている.その発展として本課題では,DSBが小核ゲノムを切断する位置を明らかにして位置のアノテーションを行い,ゲノム構造と切断部位の関係を明らかにする.具体的にはタグ融合TOP2G発現株を用いた Chip-seqを試み,そのピークからDSBが切断する部位を明らかにする.
3)DSB 修復に伴う配偶核ゲノムのエピジェネティクス変化:ES細胞やiPS細胞など脱分化細胞では,ヒストンリジン残基の高アセチル化が普遍的な現象として観察されている.2016年の研究からDSBが修復された配偶核でK18, K27, K36がアセチル化されることを新たに捕らえた.2017年度でも引き続いて配偶核のヒストン修飾の変化を調べ,DSB修復に伴うエピジェネティクス変化のカタログを作成する.

  • Research Products

    (5 results)

All 2017 2016 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results,  Open Access: 1 results,  Acknowledgement Compliant: 1 results) Presentation (2 results)

  • [Int'l Joint Research] University of Vienna(オーストリア)

    • Country Name
      AUSTRIA
    • Counterpart Institution
      University of Vienna
  • [Int'l Joint Research] York University(カナダ)

    • Country Name
      CANADA
    • Counterpart Institution
      York University
  • [Journal Article] Compositionally distinct nuclear pore complexes of functionally distinct dimorphic nuclei in ciliate Tetrahymena2017

    • Author(s)
      Masaaki Iwamoto, Hiroko Osakada, Chie Mori, Yasuhiro Fukuda, Koji Nagao, Chikashi Obuse, Yasushi Hiraoka, Tokuko Haraguchi
    • Journal Title

      J Cell Sci

      Volume: - Pages: -

    • DOI

      10.1242/jcs.199398

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] テトラヒメナの配偶核形成における DNA 二重鎖切断とその役割について2016

    • Author(s)
      福田 康弘,明松 隆彦,Ronald E. Pearlman,多田 千佳,Josef Loidl,中井 裕
    • Organizer
      第39回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
    • Year and Date
      2016-11-30 – 2016-12-02
  • [Presentation] 繊毛虫テトラヒメナの半数体核に生じるDNA二重鎖切断とメカニズム2016

    • Author(s)
      福田 康弘,明松 隆彦,Ronald E. Pearlman,多田 千佳,Josef Loidl,中井 裕
    • Organizer
      第49回日本原生生物学会
    • Place of Presentation
      岡山大学(岡山県岡山市)
    • Year and Date
      2016-10-08 – 2016-10-10

URL: 

Published: 2018-01-16   Modified: 2022-02-22  

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