2016 Fiscal Year Research-status Report
マイクロRNAによる複雑な転写後抑制様式の理解に向けたin vivo解析
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15K18476
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
三嶋 雄一郎 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教 (00557069)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 発生 / マイクロRNA / ゼブラフィッシュ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年に引き続き、miRNA経路の中核因子TNRC6AおよびTNRC6Bの母性接合子二重変異体（MZtnrc6変異体）を用い、miRNAによる転写後抑制におけるTNRC6の機能解析を行った。昨年度作成したmiR-430による抑制を検出するGFPトランスジーン系統を利用した解析を行ったところ、予想通りMZtnrc6変異体ではGFPの蛍光が顕著に強くなっていることが確認できた。しかしその蛍光はmiR-430をモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（MO）で阻害した場合や、miR-430による抑制を受けないレポーターと比較して弱いことから、TNRC6AおよびTNRC6Bを欠いた胚ではmiRNAによる抑制が部分的に解除されていると結論した。一方で、miRNAによるポリA鎖の短縮を引き起こすCnot7の機能をドミナントネガティブ型タンパク質の過剰発現により阻害した場合より、MZtnrc6変異体におけるGFP蛍光は強いことが確認された。この結果より、miRNAが引き起こすdeadenylationを介したmRNA分解と翻訳開始の抑制効果より、TNRC6AおよびTNRC6Bによる直接的な翻訳抑制の方が、miRNAによる転写後抑制全体に対する寄与が大きいことが示唆された。ユビキチン系を用いたタンパク質ノックダウンについては、オリジナルの方法を改変し、Cnot7とE3結合ドメインの融合タンパク質によってCnot1を分解する方法を試みたところ、Cnot1の顕著な分解が認められた。
また、miRNAによるmRNA分解に関わるDcp2とCnot7をゼブラフィッシュ胚で阻害した場合のmRNAプロファイリングを行い、その結果を解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、昨年度に作成していたレポーター系統を用いた実験により、TNRC6AおよびBの二重欠損時（MZtnrc6）におけるmiRNAによる抑制効果の検証を予定通り行うことができた。その結果、MZtnrc6ではmiRNAによる抑制が顕著に阻害されていたことから、今後この系統に対してレスキュー実験などを行うことによって、TNRC6の機能解析を個体発生において効率よく検証することが可能である。
ユビキチン系を用いたタンパク質ノックダウンについては、CRISPRを用いたCnot1内在遺伝子座へのGFPタグ付けが技術的に依然として難しく、やや難航している。しかしこの点に関しては、Cnot1タンパク質に結合するCnot7タンパク質とE3の融合タンパク質を利用する方法を発案し、良好な結果を得ている。今後はさらに条件を検討し、両者を併用する形で、計画を補完して進めることが可能である。
また本研究計画の基盤的知見を得る目的で、miRNAによるmRNA分解に関わるDcp2とCnot7をゼブラフィッシュ胚で阻害した場合のmRNAプロファイリングを行い、これら２つの因子がmiRNA経路において不均一に貢献していることを示唆するデータを得ることができた。MZtnrc6系統を用いてこの知見を確認するためには、時間的に猶予がない可能性が考えられたので、この結果をまずは独立した論文としてまとめ、査読付き雑誌への投稿を完了した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、確立したMZtnrc6/miR-430 GFPセンサー系統に対して、TNRC6の主要な機能ドメインを欠損させた変異型タンパク質によってレスキュー実験を行うことで、miRNAによる転写後抑制におけるTNRC6の機能をin vivoにおいて可視化して評価する。さらに胚発生期における詳細な表現型解析を行うことで、TNRC6の生理的な機能面の評価を平行して行う。改変を加えたユビキチン系を利用したタンパク質ノックダウン法は、Cnot1以外の候補因子に対しても適用できるように結合因子や発現レベルなどの条件を十分に検討し、各候補因子のmiRNA経路における役割を評価できるようにする。またMZtnrc6胚の有用性が確認できたので、RNA-seqによってmRNA発現プロファイルを解析し、遺伝子発現の観点からもTNRC6の機能性を解析する方向で実験を進める。
投稿中のDcp2とCnot7に関する論文は、miRNAによる抑制機構を詳細に理解する上で重要な知見となると期待される。そのため、計画当初より優先順位を繰り上げ、出版のための追加実験を重点的に行う。今後得られるMZtnrc6を持ちいた実験データについても早急にとりまとめ、投稿、発表できるようにする。
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