2015 Fiscal Year Research-status Report
神経特異的RNA結合蛋白質HuDが担う部位特異的翻訳制御機構の解析
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15K18480
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| Research Institution | Kinki University |
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Principal Investigator |
深尾 亜喜良 近畿大学, 薬学部, 助教 (50733979)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | RNA結合蛋白質 / 翻訳制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高等真核生物における遺伝子発現制御は非常に多岐にわたっており、単純なmRNAの転写量および翻訳量調節のみでは説明できない生命現象が数多く存在する。なかでも発生や分化においては、ある特定の遺伝子が特定の時期・場所に適正量供給されることが重要である。とくに神経細胞のような特殊な形態をした細胞では、外部からのシグナルに即座に応答するためにmRNAの転写後レベルでの制御が必須である。そして、シグナルに応答しmRNA翻訳のスイッチとなるのがRNA結合蛋白質である。本研究における目的は、神経特異的に発現するRNA結合蛋白質HuDが標的mRNAと結合し適切な場所へと輸送される際に、どのような機構で標的mRNAの翻訳が抑制されるかを解明することである。
本年度の研究は、これまでの国内外の報告によりHuDとの相互作用が明らかになっている既知の因子（KIF3A、IMP1、SMN）について、HuDの翻訳活性化機能に対する影響を評価することから開始した。まずは各候補因子を培養細胞に過剰発現させ、免疫沈降法によってHuDとの相互作用を確認した。その結果、これまでの報告通り各因子とHuDとの細胞内での相互作用が検出できた。また、KIF3AについてはRNA結合能を欠失させたHuDの変異体との相互作用も確認されたため、KIF3AとHuDが直接結合している可能性が示唆された。SMNについては、既にHuDとの結合部位として同定されているTudorドメインに変異を導入することによって、HuDと相互作用しないSMN変異体を作成した。さらにIMP1については、標的mRNAではない一般的なmRNA（cap-polyA mRNA）の翻訳に対しても阻害的な効果を有することを無細胞in vitro翻訳システムによって明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、HuDとの相互作用が明らかになっている既知の因子（KIF3A、IMP1、SMN）においてHuDのもつmRNAの翻訳活性化機能との相関を解析するという目的で研究を行った。具体的には、前述の各候補因子に対して大腸菌大量培養系により精製したリコンビナント蛋白質を、当研究室の有する無細胞in vitro翻訳システムに加えることによってHuDの翻訳活性化機能との相関を評価するという計画で行った。しかしながら、純度の高いリコンビナント蛋白質を得ることが困難であると判断し、哺乳類培養細胞への過剰発現による解析へ移行した。そして、各候補因子についてHuDとの免疫沈降実験を実施し、これまでの報告通りHuDとの相互作用が確認できたことに加えてKIF3AについてはHuDとの直接結合を示唆する結果を得た。また、IMP1を過剰発現させた培養細胞抽出液を用いた無細胞in vitro翻訳システムにおいて、これまで報告のなかったIMP1の一般的なmRNA（cap polyA mRNA）翻訳に対する阻害効果について興味深い結果を得た。以上のことから、候補因子がHuDの翻訳活性化機能と拮抗的に働く可能性については言及できてはいないものの、ある程度の進展および新たな知見を得られたため、このような評価としている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究によって、各候補因子のリコンビナント蛋白質は高純度で得られなかったため哺乳類培養細胞を用いた過剰発現系による無細胞in vitro翻訳システムに移行した。そして、前述のようにIMP1がmRNAの翻訳阻害機能を有するという結果が得られたため、次年度ではこのシステムによってIMP1だけではなく他の候補因子KIF3AおよびSMNに関しても同様の解析を行う。また、本システムによってある一定の結果が得られることは期待できるが、因子の過剰発現によって直接的に細胞性質の変化が起こる可能性も考えられるため、大腸菌大量培養系によるリコンビナント蛋白質の精製法についても条件検討を続けると共に、培養細胞を用いたリコンビナント蛋白質精製についても着手する。これらの方法によってHuDの翻訳活性化機能を阻害する因子が確認された場合、ショ糖密度勾配遠心およびmRNA pull-down法を用いてHuDによるmRNA翻訳活性化機構のどのステップを阻害しているのかを解析する。特に、HuDと直接結合することを発見している翻訳開始因子eIF4AおよびeIF3を中心に検証する。
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[Journal Article] Regnase-1 and Roquin Regulate
a Common Element in Inflammatory mRNAs by Spatiotemporally Distinct Mechanisms2015
Author(s)
Takashi Mino, Yasuhiro Murakawa, Akira Fukao, Alexis Vandenbon, Hans-Hermann Wessels, Daisuke Ori, Takuya Uehata, Sarang Tartey, Shizuo Akira, Yutaka Suzuki, Carola G. Vinuesa, Uwe Ohler,
Daron M. Standley, Markus Landthaler, Toshinobu Fujiwara, Osamu Takeuchi.
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Journal Title
Cell
Volume: 161
Pages: 1058-1073
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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