分子モーターの力応答を通じた協同的な輸送現象の基礎づけ

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K18524
• Research Institution: National Institute of Information and Communications Technology
• Principal Investigator: 鳥澤 嵩征 国立研究開発法人情報通信研究機構, 未来ICT研究所 バイオICT研究室, 研究員 (60749406)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 分子モーター / ダイニン / キネシン / 細胞内輸送

Outline of Annual Research Achievements

生体内で分子モーターによって担われている輸送現象を，分子レベルの性質からボトムアップ的に理解するために，本年度はまず特定の輸送現象に関与していることが知られている分子モーターを単離精製し，その運動観察を行うことで分子の性質の特徴付けを進めた．具体的には，初期エンドソームの輸送を担っているプラス端方向性のキネシンであるKIF16B，およびマイナス端方向性のキネシンであるKIFC1のクローニングをヒト培養細胞から得たcDNAを用いて行った．得られたキネシンの遺伝子は，マイナス端方向性のモーターである細胞質ダイニンの遺伝子と合わせてヒト培養細胞発現系に導入し，単離精製した．
精製したタンパク質を用いて一分子運動観察を行い，速度や微小管との相互作用時間，また運動の拡散係数といった運動の基本的な性質を測定した．
また，一分子レベルでの観察に加えて，初期エンドソームマーカーであるRab5aのクローニングも行い，GFPを付加した遺伝子をヒト培養細胞に導入することで，細胞内輸送の観察も行った．
上記の実験の結果，現在までに細胞質ダイニンの運動およびダイニンが関与する輸送において，その運動速度分布に正規分布から大きくはずれる長い裾野が存在するという特異性が明らかになってきている．この裾野は一分子の運動から多分子の運動まで一貫した割合で存在しており，細胞質ダイニンが関与する輸送において，微小管上での分子拡散が利用されている可能性を示唆している．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初予定していた種類とは異なるが，研究に用いるモーターおよび輸送小胞マーカーの遺伝子のクローニングは問題なく完了し，一分子の運動および細胞内輸送の観察と解析まで行うことができた．しかしながら，当初予定していた力学応答の測定に関しては，現在実験条件の検討段階にある．

Strategy for Future Research Activity

当初の計画にしたがって，DNAオリガミを用いた厳密な数の制御下における運動観察と光ピンセットを用いた力学応答の計測を進めていく．
細胞内での輸送現象に関しては，HEK細胞を用いている都合上，輸送小胞の運動軌跡の多くが直線的ではなく，そのため輸送のレールとなる微小管の極性の判別が難しい場合があるため，取得した画像の適切な解析方法を開発する必要があると考えている．

Causes of Carryover

実験機器のトラブルによりタンパク質発現用の細胞培養スケジュールに中断期間があり，その結果培地使用量が当初予定していたものよりも抑えられた．

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初の使用予定に従い細胞培養用の培地購入に充てる．