2016 Fiscal Year Research-status Report
分裂酵母における胞子への選択的ミトコンドリア継承機構の解明
| Project/Area Number |
15K18525
|
|---|
| Research Institution | Gunma University |
|---|
Principal Investigator |
高稲 正勝 群馬大学, 未来先端研究機構, 助教 (20573215)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 分裂酵母 / 減数分裂 / 配偶子形成 / ミトコンドリア / 細胞新生 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリア (Mt)は細胞の生存に必須なエネルギー生産を担うオルガネラであり、新規に生成されないため、細胞系列の維持には娘細胞がMtを適切に継承する必要がある。またMtの機能低下は代謝・神経疾患や老化の原因となる。分裂酵母の胞子形成時には、母細胞から新生胞子へ確実にMtが分配されるが、その分子機構は不明である。申請者はこれまでに胞子形成関連因子npg1遺伝子破壊株では胞子へのMt分配が異常になり、また胞子の生存率が低下することを発見した。本研究では胞子形成をモデル系として、細胞新生におけるMtの分配機構および品質管理機構の解明に迫る。平成28年度に実施した研究の成果は以下の通りである：
（1）胞子形成期におけるオーロラキナーゼB Ark1タンパク質量の変動の解析
Ark1のプロモーター領域を解析したところ減数分裂特異的な転写因子mei4の結合モチーフであるFLEX配列が複数検出された。これは減数分裂および胞子形成時期におけるArk1タンパク質量の上方制御を示唆する。そこでArk1タンパク質の量的変動を実際に計測するためのHAタグ融合型のArk1発現株を作製し、ウエスタンブロット法でバンドが検出されることを確認した。またこの株にさらにpat1-114変異を導入することで、減数分裂期に高度に同調させた細胞集団中のArk1タンパク質量を計測することが可能になった。
（2）Npg1とArk1の遺伝学的相互作用
Npg1-GFP株と薬剤感受性Ark1変異株を交配させてnpg1-GFP ark1-as株を作製したところ、この株では野生株や単独変異株と比較して胞子形成効率が低下していた。さらにNpg1局在を観察した結果、Ark1野生株では観察されないような異常なNpg1-GFPドットの局在が確認された。これらの結果はArk1活性がNpg1の正しい細胞内局在に重要であることを示唆する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当研究課題の目的は、申請者が発見した分裂酵母の胞子形成因子Npg1の活性および局在の制御機構の解明と、胞子形成時における適切なミトコンドリア継承機構の解析である。
現在までにNpg1はオーロラキナーゼB Ark1と核内で共局在すること、npg1とark1変異は胞子形成において正の遺伝学的相互作用を示すこと、またArk1の活性がNpg1の局在を制御することを明らかにした。さらにark1は減数分裂期IとIIの間に、npg1と同様に発現量が増大することが知られている。これらの結果はArk1が胞子形成時にNpg1の局在や活性を制御していることを強く示唆するものである。
細胞内シグナル伝達に関与するキナーゼとしてのark1の機能は、減数分裂I以降以外の時期では詳細に解析されており、有用な変異株も既に多数製作されている。本研究でもそれらの解析法のノウハウや変異株を流用することができる。具体的にはNpg1にはArk1による予想リン酸化サイトが複数存在するため、これらの残基を非リン酸化型に改変した変異npg1株を作製して解析すれば、Ark1によるリン酸化とNpg1の活性の関係を厳密に検証することが可能である。
従って本研究の目的の一つであるNpg1の上流の制御機構の解析についてはほぼ見通しが立ったと言える。
また今後の実験に必要な変異株はほぼ作製が完了しつつある。
よって現在までに得られた研究成果は本研究課題の研究目的に則して、概ね順調な達成度であると言える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
現在までにオーロラキナーゼ Ark1が胞子形成因子Npg1の局在や活性を制御することを示唆する結果が得られている。今後はこの仮説を厳密かつ詳細に検証することで、Npg1の上流の制御機構を明らかにする。具体的には以下の実験を予定している：（1）ark1変異株におけるNpg1の局在の観察。；（2）疑似リン酸化型／脱リン酸化型 npg1変異株の機能解析。
|
| Causes of Carryover |
当初は高開口数対物レンズやパートタイム技術員の雇用を予定していたが、申請者が所属する研究機関の共同利用機器として高開口数対物レンズを備えた顕微鏡が利用可能になり、また博士研究員雇用のための予算が配分されたため、その分の研究費を次年度分に繰り越した。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今後は翌年度以降に請求する研究費と合わせて、研究の進捗状況を鑑みつつ、質量分析の受託費用やルーティン用途用顕微鏡の購入に充てる予定である。
|
