2016 Fiscal Year Research-status Report

長鎖非コードRNAは如何に転写因子を制御するか：実生時ストレス応答機構をモデルに

Research Project

Project/Area Number	15K18550
Research Institution	University of Tsukuba
Principal Investigator	木下奈都子筑波大学, 生命環境系, 助教 (80716879)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	non protein coding RNA
Outline of Annual Research Achievements	今年度は、発芽試験をより細かなタイムスケールで追加・追試実験を行い、個体レベルでの表現型および遺伝子発現をより詳細に解析することができた。乾燥種子では、親水性タンパク質の高蓄積などのメカニズムによって、水分含量が9割程度低下した状況下でも胚珠が生存し、水分と光条件が適した状態では発芽できる状態を保っている。つまりこれは、高度な耐乾燥ストレス機構である。発芽直後の特異的なタイムウィンドウの範囲で植物が高塩・乾燥など、細胞が高浸透圧として感受する環境ストレスに遭遇すると、この種子形成時のストレス耐性機構を介して環境ストレスに応答し、ストレス耐性に必要な生理的プロセスが実行される。本研究における長鎖非コードRNAは種子形成時と発芽時プロセスにおいて重要な役割を担っており、その分子的なメカニズムの一部に迫ることができた。さらに、その過程で開発した生きた植物細胞におけるRNA分子の細胞内局在性について、この技術の汎用性を高めるためにベクターへ改良を含めるなど、一般的な技術にするための追加実験を行った。具体的には、外来DNAにより形質転換された細胞を抗生物質耐性ではなく、ビジュアルマーカーによる判別するベクターの改良、さらにそれをハイスループットで行えるメソッドへの移行である。この改良は、時間を要するが同じ代では形質のバラツキが少ない種子を介した継代に比べて、一過性発現系における解析では必須だと考えられた。さらに、一過的発現系では結果までに要する時間が短いこと、さらに外来遺伝子の発現レベルが種子による継代に比べて高いことから、ハイスループットに適していると考えられる。つまり、クローニングとその後の解析両方においてハイスループットが可能な技術改変を行うことができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 発芽時及び種子形成時における目的遺伝子が介するストレス応答における分子メカニズムにとおいて、当初予定していた実験を行い、その結果が得られた。さらに、細胞局在性解析におけるツールボックスの開発においても、材料と観察両方においてハイスループットが可能なツールを開発し、汎用性のあるものにした。
Strategy for Future Research Activity	今後は、論文の執筆を終わらせることと論文の提出とレビューワーからの追加実験における対応である。発芽時のストレス応答において中心的な役割を担う転写因子との関係にも言及できる追加実験も計画している。
Causes of Carryover	今年度は、逆転写酵素やqPCRなど、高額な酵素などを含む分子生物実験用の消耗品が想定外に必要だった。しかし、技術補佐員の技術力はよかったため、消耗品は高額であったが、時間・人数は当初予定したよりも少なくなったため、結果的に次年度使用額が生じた。
Expenditure Plan for Carryover Budget	消耗品と人件費、両方が必要であるが、実験に要する消耗品を優先せざるを得ない状況である。