2015 Fiscal Year Research-status Report
ジベレリンによる共生シグナルネットワークへの干渉機構の解明
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15K18561
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
武田 直也 基礎生物学研究所, 共生システム研究部門, 助教 (60571081)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 共生 / 植物微生物相互作用 / 根粒菌 / 菌根菌 / ジベレリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物と共生菌である根粒菌、アーバスキュラー菌根菌（以下、菌根菌）との相互作用は、共生菌からの養分供給によって宿主植物に大きな生育促進効果を与えることが知られている。この共生では、宿主植物内へ共生菌が侵入し、共生器官を形成することによって養分供給が可能となることから、共生菌を宿主植物体内に受け入れ、共生を成立させる感染過程が重要な過程となる。この感染過程ではさまざまな共生遺伝子が発現し、それらの遺伝子機能によって共生菌の侵入を制御している。我々は、これらの共生遺伝子発現を制御する因子として、植物ホルモン「ジベレリン」(GA)に注目した解析を行っている。GAは共生に正負、双方の作用をもたらすが、この作用は共生遺伝子発現によるものが大きいことが明らかとなった。そのため本課題では、この共生遺伝子発現制御に関する分子機構の解明と、この共生遺伝子の変動が共生菌の感染過程にもたらす作用についての解析を行った。
これまでの研究で明らかとしたGA濃度変動により影響を受ける共生遺伝子は、数種の遺伝子のみであったが、より網羅的にGAシグナルの変動によって発現量に影響を受ける遺伝子群を同定するため、RNA-Seqを用いたトランスクリプトーム解析を行った。ここではGA添加に加え、GA合成阻害剤の添加したマメ科植物ミヤコグサの根を用い、その発現プロファイルの取得を行った。また、すでに同定しているGA応答性の共生遺伝子のプロモーターを詳細に解析し、この発現を制御するシス領域の探索を行い、菌根共生遺伝子RAM1のプロモーター上にGA応答性のシス領域を発見した。
これまでの植物‐微生物相互作用への植物ホルモンの関与は、生理学的応答の変化の観測に留まることが多く、その分子機構についてはほとんど分かっていなかった。しかし、この発見により、ホルモンシグナルと共生シグナルの合流点と干渉機構についての解明が期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析により、ジベレリン濃度変化に応答する網羅的な遺伝子の探索を行った。この解析では、すでに次世代シーケンスによるデータの取得を完了し、現在、シーケンスデータをインフォマティクス手法を用いて解析中である。また、共生シグナル分子であるNod factorやキチンオリゴマーを添加した植物でのシーケンスデータも取得しており、これらのデータ解析により、新規の共生シグナル、ジベレリンシグナル双方に制御される共生遺伝子群を同定する。
また、先行研究により同定していたGAと菌根共生応答性の遺伝子RAM1のプロモーターGUS活性を指標として、プロモーターバッシング解析（プロモーターを短くした複数のコンストラクトを宿主植物へ導入し、GA応答性がみられなくなる領域を特定する）を行った。この解析の結果、低いGA濃度環境下でRAM1発現を誘導するGA応答領域を特定し、Low gibberellin response region (LoGA-RE)と名付けた。
LoGA-RE領域を介したGAによるRAM1誘導は共生応答と独立して誘導することができ、RAM1は一般的なGA応答反応にも機能することが推定された。このLoGA-RE配列は、すでにin silico解析から推定されていた配列とは異なっていた。また、この応答領域以外にもGA応答性の領域が存在していることが示唆される結果が得られており、その領域の探索を開始している。これらの解析によって、低い共生菌感染率と低GA含量を示す共生変異体nsp1におけるectopicな共生遺伝子群の発現誘導は、LoGA-REを介して生じていることが推定された。
現在、同様のアプローチで、ジベレリン応答と根粒共生シグナル応答の遺伝子NINに対するGA応答領域と共生応答領域との関係についても解析を続けている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２７度の解析で得られたRNA-seqによるシーケンスデータをインフォマティクス的手法を用いて解析し、ジベレリン応答・共生シグナル応答の双方によって制御される共生遺伝子群を網羅的に同定する。この解析では、共生シグナル分子であるNod factorやキチンオリゴマーを添加した植物でのシーケンスデータの解析結果も統合し、さまざまな共生シグナルによって共通、特異的に誘導される遺伝子群の分類などを行い、その機能特定に役立てる予定である。また、RAM1 promoter上から同定したジベレリン応答領域LoGA-RE以外にも、ジベレリン応答領域の存在が示唆されたことから、プロモーターバッシング解析を引き続き行い、新たなジベレリン応答領域の同定に取り組む。
この同定したシス領域をタンデムにつないだ配列を35S minimum promoter (46 bp)と結合し、シス領域単独でのGA 応答性の確認と、塩基置換などの変異導入により、シス領域の絞り込みを行う。そして、同定したシス因子をBait として、酵母１ハイブリッド法によるトランス因子の探索を開始する。このトランス因子の探索には既知の共生転写因子等も含めて解析を行う予定である。
これらの研究によって、共生とジベレリンシグナルの合流点に位置するシグナル因子や伝達機構を明らかとし、異なるシグナルネットワーク間での干渉作用の分子メカニズムを解明する。
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| Causes of Carryover |
当初予定していた技術支援員の雇用経費は、適任者が見つからなかったことから平成２８年度に繰り越すこととした。物品費については、平成２７年度に予定していた次世代シーケンス費用は運営費で賄うことができたため、平成２８年度により広範に行う可能性のある次世代シーケンス費用、あるいは人件費として利用することとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究の推進を図るため、平成２７年度から繰り越した研究費とともに、技術支援員を当初の計画より長時間での雇用、あるいはポスドクの雇用に切り替えて使用する。
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