2015 Fiscal Year Research-status Report
CRISPR/Casシステムによるイネいもち病菌のゲノムワイド遺伝子破壊法の確立
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15K18647
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
荒添 貴之 神戸大学, 工学(系)研究科(研究院), 研究員 (40749975)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | CRISPR/Cas system / ゲノム編集 / イネいもち病菌 / 遺伝子ターゲティング / ポストゲノム / Pyricularia oryzae / 糸状菌 / 網羅的遺伝子破壊 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
主要作物であるイネに重要病害を引き起こすイネいもち病菌 (Pyricularia oryzae) は，その重要性から植物病原菌で初めて全ゲノムが解読されたモデル植物病原糸状菌である。本研究では，ポストゲノム時代における膨大なゲノム情報を網羅的に解析する手法として，人工ヌクレアーゼCRISPR/Casシステムの糸状菌への最適化とゲノム編集技術を用いたハイスループット遺伝子破壊法の確立を目的とする。
CRISPR/Cas9は標的DNAとguide RNAのハイブリッド領域をCas9ヌクレアーゼが切断する人工ヌクレアーゼである。本ヌクレアーゼシステムを糸状菌に適用するために，Cas9ヌクレアーゼのコドン使用頻度を糸状菌に最適化した。また，guide RNAの高発現化のためにいもち病菌のU6 small nuclear RNAを同定し，その上流配列をRNA polymerase III系プロモーターとして使用した。以上より糸状菌型CRISPR/Casシステムの確立に成功した (Arazoe et al., 2015)。本システムは網羅的遺伝子機能解析を視野にいれ，Golden Gate cloning法 (Cermak et al., 2011) によるワンステップでのヌクレアーゼ作製が可能なように設計している。本システムの利用により，相同組換え修復を介した遺伝子ターゲティング効率を36～100%まで向上させることに成功した。また，相同組換え修復経路の一つであるシングルクロスオーバーを介した高効率標的遺伝子ノックアウト・ノックイン・塩基置換導入法の確立に成功した。一方，相同組換え修復と拮抗的に働く非相同末端結合修復機構を介した標的遺伝子改変では，糸状菌ゲノム特有の性質と考えられる広域に渡る欠失が確認された。本問題を解決するために，ゲノムを切らずに改変する新たな技術開発に着手した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画では，非相同末端結合修復を介した相同配列を用いない簡易的な遺伝子破壊法の確立とそれを基盤としたゲノムワイドな遺伝子機能解析系の確立を目的としていた。しかしながら，糸状菌ゲノム特有の現象と考えられる広域の欠失が確認された。そこで，ゲノムを切らずに書き換える新たなゲノム編集技術開発に着手し，本技術が糸状菌に対して有用であることを示した。従って，新たなゲノム編集技術開発に成功した点で当初の計画以上に研究が進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回構築したベクターはワンステップでヌクレアーゼまたは標的遺伝子改変ベクターが作製できるように設計されている。そこで，本ベクター特性におけるヌクレアーゼ・改変ベクターライブラリー作製の条件検討をおこない，複数の遺伝子を標的とした破壊株ライブラリーの構築をおこなう。破壊株ライブラリーを表現型から解析し，これまで未詳であったいもち病菌の病原性ならびに変異特性に関わる新たな因子の同定を試みる。また本技術を麹菌に応用し，産業への応用展開を視野にいれ研究を進めていく。
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[Journal Article] Tailor-made CRISPR/Cas system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus2015
Author(s)
Arazoe, T., Miyoshi, K., Yamato, T., Ohsato, S., Arie, T. and Kuwata, S.
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Journal Title
Biotechnology and Bioengineering
Volume: 112(12)
Pages: 2543-2549
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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