2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K18664
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
松岡 聡 埼玉大学, 理工学研究科, 助教 (90509283)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 糖脂質 / 枯草菌 / 膜タンパク質 / 細胞形態 / ECFシグマ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
枯草菌の糖脂質はUgtPによってジアシルグリセロールにUDP-Gluのグルコースが転移することによって段階的に合成される。UDP-Gluの合成に関わる遺伝子の破壊株でもugtP破壊株と同様の形態を示したことから、糖脂質の欠損が形態異常の原因であることが示唆された。そこで、枯草菌の細胞分裂に必須の二成分制御系WalKRの制御に関与するSigIに注目して解析した。SigIは膜タンパク質RsgIに制御されており、ugtP破壊株においてSigIの転写活性が上昇したこと、大腸菌を用いた異種発現系において糖脂質合成酵素遺伝子ugtPを発現させることでSigIの活性が抑えられることから、糖脂質がSigIの活性制御に関わることが示唆された。次に、sigIプロモーター領域に存在するシスエレメントの変異・欠失を導入した配列とlacZの転写融合を作製し、枯草菌染色体に導入して糖脂質の有無によるsigI転写への影響を解析した。糖脂質の欠損により、SigI認識配列によるSigI活性が上昇したことが示された。さらに、WalRの活性も糖脂質の影響を受けることが示唆された。そこで、walRのC末端にHisタグを導入して、WalRのリン酸化レベルを解析したころ、ugtP破壊株では野生株と比べてWalRのリン酸化が亢進した。これらの結果から、枯草菌の細胞分裂に関わる二成分制御系WalKRとSigI の制御に糖脂質が重要な役割を持つことが示唆された。また、Acholeplasma laidlawii由来の糖脂質合成酵素遺伝子の導入によっても形態異常が相補された。更に糖脂質欠損条件で活性化したECFシグマ因子の活性も減少した。以上から糖脂質が枯草菌形態維持やECFシグマの制御に重要であることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)糖脂質特異的プローブの作製と局在観察については、異種細菌由来の糖脂質合成酵素遺伝子を入手することができたため、これら遺伝子を枯草菌糖脂質欠損株に導入して、分子種による生理機能の違いを解析することを優先した。平成28年度に引き続き糖脂質特異的プローブ作成と局在観察を予定している。
(2)アンチシグマタンパク質の細胞膜局在解明について、細胞外でも発光可能なsfGFP遺伝子を組み込んだプラスミドを新たに構築した。本プラスミドにアンチシグマ遺伝子をクローニングした。
(3)大腸菌を用いた異種発現系でのECFシグマ因子活性化における糖脂質の影響解析について、系を構築しシグマM, V, Xについて解析した。成果を論文にまとめ公表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．細胞形態維持における糖脂質の機能を理解するために、細胞内での糖脂質の局在を把握することは重要である。しかしながら、脂質は遺伝子の直接の産物ではないため改変が難しく、また特異的プローブもほとんど市販されておらず生体内での局在を解析するのは難しい。現在、糖脂質に特異的なプローブは開発されていない。そこで、枯草菌糖脂質に特異的なプローブを探索して枯草菌細胞内での糖脂質の局在を明らかにする。現在までにM13ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによって糖脂質を特異的に認識するペプチド候補を3種類得て、配列も決定している。予備実験では、GFPとの融合タンパク質を発現した枯草菌細胞では、細胞膜全体にドット状の蛍光が観察された。次の段階として、化学合成した候補ペプチドをFITC標識して枯草菌細胞での糖脂質の局在を蛍光顕微鏡法により明らかにする。また今回作製したsfGFP融合プラスミドにアンチシグマ遺伝子をクローニングして糖脂質・アンチシグマタンパク質の局在を可視化して細胞膜上のドメインを明らかにする。
２．アンチシグマタンパクの膜貫通領域が糖脂質との相互作用に重要であるとが実験的に示唆された。そこで、膜貫通領域に変異を導入したアンチシグマタンパク質を、大腸菌異種発現系に導入して解析し、糖脂質との相互作用に重要なアミノ酸残基を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
平成27年度に実施予定だった糖脂質特異的プローブの作製と局在観察について、異種細菌由来の糖脂質合成酵素遺伝子を分与されたため、異種遺伝子発現実験を優先した。そのため、糖脂質特異的プローブの作製と局在観察に必要な研究費を繰り越すこととなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度に糖脂質特異的プローブの作製と局在観察を実施予定である。
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