2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K18670
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
小笠原 寛 信州大学, 学術研究院繊維学系, 助教 (30535232)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | バイオフィルム / 大腸菌 / Curli線毛 / CsgD / CsgA / 転写因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
H27年度は当初計画通り、1)CsgA発現抑制に関わる転写因子の探索とその転写抑制の分子機構の解明、2)新規Curli線毛形成抑制転写因子YehTの機能解明、3) CsgDによって制御されるCurli線毛形成阻害機構の探索と解明を目指し研究を実施した。(1)についてはcsgA発現制御に関わる転写因子の探索するために、csgAプロモーターを含むDNA断片を用いたPS-TF screeningを実施した。また、大腸菌ゲノム上でcsgAプロモーター領域をlacZと融合させたレポーター株に、PS-TF screeningにより明らかとなったcsgAプロモーター特異的結合転写因子をコードする遺伝子の高発現プラスミドコレクションを導入し、csgA発現抑制に関わる転写因子探索のためのアッセイ系の構築を行った。(2)については、新規Curli線毛形成抑制転写因子YehTについて、csgDプロモーター上における結合部位の同定を試みた。また、YehTのCurli線毛形成抑制に至る分子機構の解明を目指し、yehT欠損株、およびyehT過剰発現株を用いたcsgDおよびcsgBAの転写解析を行い、ゲルシフトアッセイによりcsgDおよびcsgBAプロモーターに対するYehTの結合の有無を確かめた。(3)についてはCsgD制御下のCurli線毛形成阻害に関わる因子を同定するために、これまでに明らかとされているCsgD標的遺伝子の欠損株においてCsgDを過剰発現させ、Curli線毛形成阻害が抑制される遺伝子の同定を試みた。さらに、CsgD標的遺伝子の過剰発現プラスミドを作製し、Curli線毛線毛形成への阻害効果、およびcsgBA発現への影響および大腸菌表層ストレス応答機構の活性化への関与について検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究概要の実績に示したH27年度の当初計画(1)～(3)に沿って研究を実施し、(1)ではPS-TF screeningを用いたcsgAプロモーター制御因子の探索により、新たに複数のcsgA制御転写因子候補を見出した。現在までにこれらのうち、csgA発現抑制に顕著な影響を与える新規転写因子の同定には至っていないが、今後、転写因子高発現プラスミド、およびcsgA-lacZレポーター株を用いた解析を、H28年度においても継続して実施する。(2)については、DNase I footprintingによる新規Curli線毛形成抑制転写因子YehTのcsgDプロモーター上における結合部位の同定には至らなかったものの、既知標的遺伝子yjiYプロモーター上のYehT結合配列との比較により、csgDおよびcsgAプロモーター上におけるYehT結合部位を推定し、実際にGelshift assayによりYehTが両プロモーターに結合することを確認した。さらに、yehT欠損株、yehT過剰発現株を用いた解析により、csgD,csgA発現およびバイオフィルム形成がYehT依存的に抑制されることを明らかにした。(3)についてはCsgD制御下のCurli線毛形成阻害に関わる因子を明らかにするために、これまでに明らかとされているCsgD標的遺伝子の欠損株においてCsgDを過剰発現させ、Curli線毛形成阻害が抑制される遺伝子Xの特定に成功した。さらに、新たに見出したCsgD支配下のCurli線毛形成阻害因子Xをコードする遺伝子の過剰発現株を用いた解析において、Curli線毛形成の著しい阻害、およびcsgBA発現の著しい抑制効果が観察され、表層ストレス応答機構の活性化には関与しないことが明らかとなった。また、精製されたCurli線毛形成阻害因子XによるCsgA蛋白の凝集体形成阻害が確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
大腸菌のバイオフィルム形成の主要な構成因子であるCurli線毛の形成阻害に関わる分子機構の全容解明を目指し、H28年度は(1) csgBAプロモーター直接制御転写因子による転写制御機構の全容解明、(2) 機能未知転写因子YehTの標的遺伝子の同定と活性化シグナル分子の解明、(3) CsgDに制御されるCurli線毛形成阻害因子の機能解明を目指し以下の研究を実施する。(1)については平成27年度に新たに見出したcsgBA発現制御候補転写因子について、csgAプロモーター制御における分子機構の機能解明を目指し、転写因子欠損株を用いたcsgAプロモーター活性の測定やin vitroにおける詳細な転写実験等を実施する。(2)については機能未知転写因子YehTの更なる機能解明を目指し、Genomic SELEX解析を実施する。標的遺伝子が明らかになった場合、その機能からYehTを活性化するシグナル分子の予測を行う。(3)については H27年度に同定したCsgD制御下の新規Curli線毛形成阻害タンパク質Xの機能を明らかとするために、3×FLAGタグ融合新規Curli線毛形成阻害タンパク質Xを用いて、アフィニティー精製によりカラムより溶出させた相互作用タンパク質を、SDS-PAGEにより分離し、質量分析を行うことで同定する。また、FLAGタグ抗体を用いて新規Curli線毛形成阻害タンパク質Xの細胞内局在部位の探索を行う。また、相互作用タンパク質が見出された場合、それら欠損株を準備し、細胞内におけるこれらタンパク質のCurli線毛形成阻害機構に与える影響について検証する。
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