2016 Fiscal Year Research-status Report

鞭毛形成マスターレギュレーターFlhD4C2による代謝制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	15K18676
Research Institution	Rikkyo University
Principal Investigator	高田啓立教大学, 理学部, ポストドクトラルフェロー (70747899)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	大腸菌 / 生存戦略 / FlhDC
Outline of Annual Research Achievements	環境中の微生物は栄養源の遷移を量・質ともに正確に感知し、それら栄養源に細胞内代謝を最適化することで環境変化に適応している。この適応機構には増殖形態の変化を伴い、その代表的な例として、鞭毛形成・バイオフィルム形成がある。この両形態はbistable(双安定性)な関係性にあり、細胞集団中の個々の細胞は生長環境に応じて、そのどちらの増殖形態を選択するか常に迫られている。本研究では大腸菌の鞭毛形成マスターレギュレーターFlhD4C2 に着目し、Genomic SELEX法を用いた網羅的解析により同定した新規FlhD4C2制御候補遺伝子群の解析と、栄養源の遷移に伴ったこれら遺伝子群の動態を解析することにより、生長環境を感知しながら生き残り戦略を選択していく過程の全体像の把握を目指し、実施したものである。本年度は、同定した新規FlhD4C2制御候補遺伝子群に関して、ゲルシフトアッセイにより、そのPromoterへの結合強度を比較することで、FlhD4C2による転写制御の強度を比較・検討した。また本系を用いて、FlhD4C2に作用するリガンドの探索も行ない、詳細な制御機構の解明を目指した。新規FlhD4C2制御候補遺伝子群の多くは中央代謝系に関与する遺伝子が多く、flhDC欠失により、中央代謝系への影響が伺える。この点に関して、合成培地に添加する炭素源・窒素源等を変化させた場合に、生育に対してどのような変化が起きるか、野生株とflhD破壊株を用いて比較・検討を行った。前年度に構築した一細胞レベルでの転写変動計測系を用いた解析系の結果を、上記の結果に組み込めるか検討を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ゲルシフトアッセイにより、新規FlhD4C2制御候補遺伝子のPromoterへの結合強度を比較し、結合する領域をある程度絞ることができた。また、各PromoterによってFlhD4C2の結合強度が大きく異なることがわかった。これらPromoter付近には既存のFlhD4C2結合配列は存在しない。今年度得られた結果をもとに、現在新奇のFlhD4C2結合配列の推定を進めている。 flhD破壊株は、合成培地において合成培地に添加する炭素源・窒素源等を変化させた場合に、生育への影響が大きく異なることが明らかとなりつつある。各培地条件での新規FlhD4C2制御候補遺伝子の発現変動の解析結果と合わせ、なぜ生育への影響が大きく異なるのか、その理解を進めている。以上の結果から、生長環境の栄養状態に応じて、FlhD4C2が中央代謝系の遺伝子群の発現を制御とその効果に関して明らかにできつつあり、FlhD4C2 を中心に据えた時に見えてくる、栄養源遷移時における生き残り戦略が理解できつつある。一方で、FlhD4C2の質的な制御機構の解明に関しては、計画通り進んでいない。
Strategy for Future Research Activity	昨年度・今年度の計画のうち、達成できなかったものに関して継続して研究を行う。FlhD4C2制御遺伝子に関する理解は進んだが、自身の制御機構に関して今後重点的に解析を行い、理解に努める。
Causes of Carryover	論文校閲費として確保していた予算に関して、論文作成が遅れたため今年度での使用ができなかった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	論文校閲費として使用する