腸管樹状細胞評価系による腸管炎症抑制乳酸菌の機能成分探索

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K18703
• Research Institution: Tokyo University of Science
• Principal Investigator: 島津 朋之 東京理科大学, 研究推進機構生命医科学研究所, 助教 (20616437)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 乳酸菌 / Treg / 樹状細胞

Outline of Annual Research Achievements

これまで、ある種の乳酸菌が腸管樹状細胞への機能発揮から制御性T細胞を増加させ、マウスDSS誘導大腸炎を軽減させることが明らかとなっている。本研究では、腸管樹状細胞評価系の樹立から、本乳酸菌の機構解析や機能成分の探索を行い炎症性腸疾患軽減に関わる有効成分を明らかにすることを目的としている。
生体での機能をより反映した腸管樹状細胞株の樹立のため、温度感受性変異SV40LT抗原トランスジェニックマウスを導入した。細胞密度などの培養条件、Flt3、GM-CSF、レチノイン酸等の添加により細胞株の樹立を試みているが、未だ細胞株の樹立には至っていない。一方、昨年度にGM-CSFにより分化した樹状細胞(BMDC)が乳酸菌のIL-10産生評価に有効である事を明らかにしている。そこで、BMDCを用いてIL-10の産生に重要な受容体の探索を行った。結果、Syk阻害剤によりIL-10の産生が抑制されることやSykのリン酸化からITAMを介するC型レクチン受容体シグナルが重要であることが明らかとなった。一方、MyD88が重要であることからペプチドグリカンを認識するTLR2の関与が考えられたがTLR2はIL-10の産生に重要ではないことが明らかとなった。乳酸菌認識に関わる特定の受容体を明らかにするためBMDCを用いたノックダウンを試みたが感染効率が悪ため、BMDCと同様の結果を見せたp53-/-由来のBMDC株、Jaws-IIを用いて受容体の探索を行っている。一方、生化学的な処理によりIL-10産生に重要な成分は核酸成分やタンパク成分ではないこと、そしてペプチドグリカンの分解産物中にTLRシグナルと協調的に働きIL-10産生を増強する物質が存在する事が明らかになった。宿主受容体、細菌成分の両面から機能性成分同定を目指している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

温度感受性変異SV40LT抗原トランスジェニックマウスは自然交配が難しく維持が困難であったが、現在は凍結胚を用いた体外受精により定期的に実験が可能となった。しかし、細胞分取による培養他、様々な条件を試したが血球系細胞の増殖は現在のところ認められない。一方、BMDCでは用事調製が必要なためスクリーニングには不向きであったが、Jaws-IIを使用できることが明らかとなり効率が向上した。
これまでの結果から、IL-10の産生にはTLRとC型レクチンの相乗効果が必要と考えており、これの詳細を明らかにしていく。

Strategy for Future Research Activity

Jaws-IIを用いてマウスの全TLRの他、Card9、Sykを標的としたノックダウンが進行中であり、この試験からTLRに関しては受容体の特定が可能と考えられる。C型レクチン受容体の特定に関しては、認識に関わるアダプター分子の絞り込みや候補受容体の発現量から当たりを付ける。また、生化学的な分離による関与成分の解明から絞り込みが可能と考えられる。その後、受容体の解明から強制発現株を樹立し責任成分を明らかにする。
また、TLRに関してはノックアウトマウスの購入から、生体における役割を解明していく。

Causes of Carryover

当初、温度感受性変異SV40LT抗原トランスジェニックマウスに関して業者より都度購入する予定であったが、凍結卵を作製することが可能となったため、購入費用が削減でき未使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

未使用額は、本研究で明らかとなったシグナル経路分子のノックアウトマウスの購入に使用予定。