2016 Fiscal Year Research-status Report
犬猫の可溶性CTLA-4検索と自己免疫疾患診断マーカーへの応用
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15K18788
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| Research Institution | Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine |
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Principal Investigator |
田川 道人 帯広畜産大学, 畜産学部, 助教 (00749468)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 可溶性CTLA-4 / CTLA-4 / splicing variant / 犬 / 自己免疫疾患 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
健常犬における可溶性CTLA-4（以下sCTLA-4）の存在を明らかにするため、健常犬より末梢血液を採取し、PBMCを分離、RNAを抽出した後、犬CTLA-4に対するプライマーを用いてRT-PCRを行った。得られたPCR産物はTA Cloningの後、シークエンス解析により塩基配列を決定した。RT-PCRでは750、650bp付近に2本のバンドが確認され、750bpは犬CTLA-4のmRNAと100%一致する配列であり、650bpは犬CTLA-4のExon3が欠損したsplicing variantであった。これは170aaから構成され、ヒトsCTLA-4のアミノ酸配列と82.9%の相同性であった。興味深いことに、ヒトやマウスで報告されている配列と比較し、犬のsCTLA-4のcytoplasmic tailはsplicingによって起こったフレームシフトにより3アミノ酸が末端で欠損していた。これは他の健常犬で行った実験でも確認されている。
次に健常犬の血清を用い、抗ヒトCTLA-4抗体を用いた免疫沈降およびウエスタンブロット（以下WB）により犬sCTLA-4の発現を確認した。WBでは23kDa付近にバンドが確認され、これはヒトで報告されたsCTLA-4蛋白の分子量と同一であった。また、同様の検討を他の健常犬2頭で行ったが同様の結果であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
自己免疫疾患症例犬の来院が少なく、サンプル数がまだ十分量に達していない。
そのため、少数例で可溶性CTLA-4の発現をELISAで確認したが、どの自己免疫疾患で有意な上昇がみられるかなどはまだ検討できていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
症例数が徐々に集まりつつあり、また他大学の動物診療施設にサンプル採取を依頼している。症例数が集まり次第、ELISAを行う予定であり、また可溶性CTLA-4を用いたin vitro試験を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
サンプル採取が滞っており、ELISAをまだ実施していないため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度での実施を検討。
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