RNAキャップ構造を介した植物マイクロRNA生成の分子基盤

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K18822
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 岩田 雄二 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 助教 (80704965)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: microRNA / シロイヌナズナ

Outline of Annual Research Achievements

シロイヌナズナを用いた遺伝学的解析から、microRNA（miRNA）生成に関与するタンパク質が多く同定されている。そのうち、SERRATE（SE）タンパク質の機能を詳細に解析するため、SEの各ドメインを欠失させたコンストラクトをデザインした。タンパク質レベルでの解析を容易にするために、N末端側にFLAGタグを付加した。ドメイン欠失SEタンパク質をSEプロモーターの制御下で発現するコンストラクトを作製し、シロイヌナズナse変異体に導入し、表現型の回復度合いを調べた。現在のところ、各ドメインの欠失により、表現型の回復度合いが異なるという予備的な結果を得た。

SEと協調して機能することが示唆されているCap Binding Complex（CBC）について詳細な解析を行うため、精製タンパク質の調製を試みた。CBCはCBP80、CBP20からなるヘテロ二量体タンパク質で、真核生物に広く保存されているタンパク質である。CBP80とCBP20を発現させるためのコンストラクトを作製し、昆虫細胞／バキュロウイルスによる異種タンパク質発現系を用いてCBP80、CBP20を発現させ、ニッケルカラムを用いた粗精製を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

SEタンパク質の各ドメインを欠失させたコンストラクトの作製に若干の遅れは見られたものの、その他のse変異体への遺伝子導入や形質転換個体の除草剤耐性を指標にした選抜などはおおむね順調に進めることが出来た。組換えCBCタンパク質の調製に関しては、CBP20は発現量が低い点が若干ネックになっているが、その他は順調に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

SEの各ドメインを欠失させた形質転換体については引き続き作製を進め、複数のラインを得た後、miRNA蓄積量やmiRNA前駆体量をノーザンブロットや定量RT-PCRにより解析を行うと共に、導入したSEタンパク質について抗FLAG抗体を用いて解析を進め、各ドメインの機能を調べることで、SEタンパク質の植物体内での機能を明らかにする。CBCに関しては、引き続き精製タンパク質の調製を進め、in vitro実験系を用いてCBCの機能を明らかにする。

Causes of Carryover

抗SE抗体の作製を初年度に予定していたが、使用する抗原の調製が間に合わなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

速やかに抗原タンパク質の調製を進め、抗SE抗体の受託作製に使用する。