Structural basis of biased signaling mediated by pharmacologically important GPCRs

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K18843
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 幸福 裕 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 特任助教 (80737940)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 構造生物学 / NMR / 膜タンパク質 / シグナル伝達 / GPCR

Outline of Annual Research Achievements

平成27年度までに、Gタンパク質共役型受容体であるβ2アドレナリン受容体とμオピオイド受容体について、特定のシグナル伝達経路を選択的に活性化するバイアスリガンドを含む、様々なリガンドが結合した状態のNMRスペクトルを取得した。その結果、膜貫通領域の構造平衡が、シグナル伝達の強度や選択性を決定していることを明らかにした。以上のように、当初の研究計画は概ね平成27年度までに完了したことから、平成28年度は、Gタンパク質共役型受容体のシグナル制御機構をより詳細に解析するため、以下の2項目を実施した。
１．δオピオイド受容体のNMR解析
δオピオイド受容体について、メチオニンメチル基を選択的に13C標識し、その周囲を2H標識することで、メチオニンメチル基を選択的に観測する方法を確立した。この方法を用い、μオピオイド受容体と同じ位置にメチオニンを変異導入した上で、リガンド依存的な化学シフト変化を観測した。その結果、μオピオイド受容体と同様の化学シフト変化がδオピオイド受容体でも観測できた。このことは、構造平衡によるシグナル伝達制御機構がGPCR一般に共通であることを示している。
２．アラニン残基をプローブとした空間分解能の向上
以上の解析は、メチオニンメチル基をプローブとして進めてきたが、メチオニン残基はGタンパク質共役型受容体の膜貫通領域に10残基程度しか存在せず、構造変化をとらえる上で、空間分解能が低いことが問題であった。そこで、新たにアラニンメチル基をプローブとすることとした。Gタンパク質共役型受容体の発現に必須な昆虫細胞発現系を用いて、アラニンメチル基を選択的に13C標識し、周囲を2H標識する方法を新規開発した（Minato et al., PNAS, 2016）。この方法をGタンパク質共役型受容体の解析に適用し、その有用性を示した。

Research Products

• [Journal Article] Conductance of P2X4 purinergic receptor is determined by conformational equilibrium in the transmembrane region (2016)
  • Author(s): Yuichi Minato, Shiho Suzuki, Tomoaki Hara, Yutaka Kofuku, Go Kasuya, Yuichiro Fujiwara, Shunsuke Igarashi, Ei-ichiro Suzuki, Osamu Nureki, Motoyuki Hattori, Takumi Ueda, Ichio Shimada
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Volume: 113 Pages: 4741-4746
  • DOI: 10.1073/pnas.1600519113
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Utilization of paramagnetic relaxation enhancements for structural analysis of actin-binding proteins in complex with actin (2016)
  • Author(s): Shuxian Huang, Ryo Umemoto, Yuki Tamura, Yutaka Kofuku, Taro Q. P. Uyeda, Noritaka Nishida, Ichio Shimada
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 6 Pages: 33690
  • DOI: 10.1038/srep33690
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Conductance of P2X4 purinergic receptor is determined by conformational equilibrium in the transmembrane region (2017)
  • Author(s): Takumi Ueda, Tomoaki Hara, Yuichi Minato, Shiho Suzuki, Yutaka Kofuku, Go Kasuya, Yuichiro Fujiwara, Shunsuke Igarashi, Ei-ichiro Suzuki, Osamu Nureki, Motoyuki Hattori, Ichio Shimada
  • Organizer: 58th Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference
  • Place of Presentation: Pacific Grove（アメリカ合衆国）
  • Year and Date: 2017-03-26 – 2017-03-31
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Identification of a Conformational Equilibrium That Determines the Efficacy and Functional Selectivity of the μ-Opioid Receptor (2017)
  • Author(s): Yutaro Shiraishi, Junya Okude, Takumi Ueda, Yutaka Kofuku, Motohiko Sato, Naoyuki Nobuyama, Keita Kondo, Takuya Mizumura, Mei Natsume, Masahiro Maeda, Hideki Tsujishita, Takefumi Kuranaga, Masayuki Inoue, Ichio Shimada
  • Organizer: 58th Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference
  • Place of Presentation: Pacific Grove（アメリカ合衆国）
  • Year and Date: 2017-03-26 – 2017-03-31
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Functional dynamics of deuterated β2-adrenergic receptor in lipid bilayers revealed by NMR spectroscopy (2017)
  • Author(s): Mei Natsume, Yutaka Kofuku, Takumi Ueda, Junya Okude, Yutaro Shiraishi, Keita Kondo, Takuya Mizumura, Shiho Suzuki, Ichio Shimada
  • Organizer: 58th Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference
  • Place of Presentation: Pacific Grove（アメリカ合衆国）
  • Year and Date: 2017-03-26 – 2017-03-31
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 細胞遊走因子、ケモカイン受容体の動的構造研究と創薬研究への展望 (2017)
  • Author(s): 幸福 裕
  • Organizer: 第87回日本衛生学会学術総会
  • Place of Presentation: シーガイアコンベンションセンター（宮崎県宮崎市）
  • Year and Date: 2017-03-26 – 2017-03-28
  • Invited
• [Presentation] 昆虫細胞発現系における高度重水素標識を用いた脂質二重膜中のGタンパク質共役型受容体の動的構造解析 (2016)
  • Author(s): 幸福 裕、上田 卓見、奥出 順也、白石 勇太郎、近藤 啓太、水村 拓也、鈴木 志歩、嶋田 一夫
  • Organizer: 第55回NMR討論会
  • Place of Presentation: 広島国際会議場（広島県広島市）
  • Year and Date: 2016-11-16 – 2016-11-18
• [Presentation] Identification of a Conformational Equilibrium That Determines the Efficacy and Functional Selectivity of the μ-Opioid Receptor (2016)
  • Author(s): Junya Okude, Takumi Ueda, Yutaka Kofuku, Motohiko Sato, Naoyuki Nobuyama, Keita Kondo, Yutaro Shiraishi, Takuya Mizumura, Mei Natsume, Masahiro Maeda, Hideki Tsujishita, Takefumi Kuranaga, Masayuki Inoue, Ichio Shimada
  • Organizer: XXVIIth International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • Year and Date: 2016-08-21 – 2016-08-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of an NMR reconstruction method to elucidate the CCR1- and CCR5-bincing modes of MIP-1a (2016)
  • Author(s): Takumi Ueda, Chie Yoshiura, Yutaka Kofuku, Masahiko Matsumoto, Junya Okude, Keita Kondo, Yutaro Shiraishi, Koh Takeuchi, Ichio Shimada
  • Organizer: XXVIIth International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • Year and Date: 2016-08-21 – 2016-08-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Conductance of P2X4 purinergic receptor is determined by conformational equilibrium in the transmembrane region (2016)
  • Author(s): Tomoaki Hara, Yuichi Minato, Shiho Suzuki, Yutaka Kofuku, Go Kasuya, Yuichiro Fujiwara, Shunsuke Igarashi, Ei-ichiro Suzuki, Osamu Nureki, Motoyuki Hattori, Takumi Ueda, Ichio Shimada
  • Organizer: XXVIIth International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • Year and Date: 2016-08-21 – 2016-08-26
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 東京大学大学院薬学系研究科生命物理化学教室ホームページ
  • URL: http://ishimada.f.u-tokyo.ac.jp/public_html/index_j.html