2016 Fiscal Year Research-status Report
高分子ナノ粒子キャリアの病原体との相互作用の可視化のための電子顕微鏡評価法の開発
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15K18849
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| Research Institution | Aichi Gakuin University |
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Principal Investigator |
高橋 知里 愛知学院大学, 薬学部, 助教 (50574448)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | バイオフィルム / ドラッグデリバリーシステム / ナノ粒子 / 電子顕微鏡 / カソードルミネッセンス / レーザーラマン顕微鏡 / イオン液体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、従来評価法に対して①イオン液体を応用した微細形態観察手法及び②ナノ領域からの蛍光可視化手法を組み込むことで、歯周病などを始めとする難治性のバイオフィルム感染症治療のための高分子ナノ粒子キャリアを設計することである。
昨年度には、①のイオン液体を応用した微細形態観察手法を確立しており、この手法を用いることで製剤および病原体の形態を捉えることに成功している。さらに、製剤と病原体の相互作用をナノスケールで明らかにし、その情報を高分子ナノ粒子製剤の設計にフィードバックさせている。今年度は、②のナノ領域からの蛍光可視化手法の確立を試みた。初めに高分子ナノ粒子製剤のラベリングに適した電子線に強い蛍光物質の探索を行い、その結果、低波長側に蛍光波長を持つ無機材料の蛍光物質がイメージング・分析に適していることを明らかにした。次に蛍光物質をラベリングした高分子ナノ粒子製剤を投与したバイオフィルムのイメージングおよび分析を行い、ラベリングした蛍光を捉えることで高分子ナノ粒子製剤が抗菌作用を示した部位を明らかにしている。特に局所分析では、1ピクセル領域からカソードルミネッセンススペクトルを取得することに成功しており、微弱な発光であっても十分なスペクトル強度が得られることを確認している。金属ナノ粒子を封入した高分子ナノ粒子製剤では、表面プラズモンの測定をすることで、無蛍光であってもイメージング・分析が可能であった。今回確立した透過型電子顕微鏡にカソードルミネッセンスを組み込んだ評価手法を用いることで、設計した高分子ナノ粒子製剤の病原体に対する抗菌作用を高感度で評価できることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、（1）金属微粒子を複合した高分子ナノ粒子製剤の設計、（2）透過型電子顕微鏡にカソードルミネッセンスを組み込んだ手法の確立とこの手法を用いた高分子ナノ粒子製剤の抗菌活性評価、（3）バイオフィルム感染症モデルマウスの作成と高分子ナノ粒子を投与したマウスの評価の検討、（4）レーザーラマン顕微鏡および走査型電子顕微鏡用高感度検出器を用いた高分子ナノ粒子製剤の抗菌活性評価、（5）表皮ブドウ球菌以外の菌を用いたバイオフィルムの形成法の検討を行った。本年度に計画していた（3）感染症モデルマウスの作成法はまだ確立できていないが、当初の計画で予定していなかった（1）（4）の研究を遂行することができた。また、次年度以降に予定していた（5）の研究を進めることができた。上記の研究を通じて、いくつかの成果を得ることができた。
【具体的な進捗状況】
生物試料を対象とした透過型電子顕微鏡にカソードルミネッセンスを組み込んだ手法を確立することができた。蛍光物質を付与した高分子ナノ粒子製剤を投与したバイオフィルムの蛍光をカソードルミネッセンス法で測定することで、バイオフィルムに付着・侵入した高分子ナノ粒子製剤の存在を捉えるのみでなく、高分子ナノ粒子製剤がもたらした抗菌効果をナノスケールで把握できることがわかった。新規に設計した金属微粒子を複合した製剤では、表面プラズモンを測定することで抗菌効果を明らかにすることができた。さらに、レーザーラマン顕微鏡および走査型電子顕微鏡用高感度検出器を用いたイメージング法・分析法を確立することで、評価の目的に合わせた手法の選択が可能となった。表皮ブドウ球菌以外の菌を用いたバイオフィルムの形成法を検討し、いくつかの菌でバイオフィルムの形成を確認している。この試みにより、次年度以降に計画している複数菌を用いたバイオフィルム形成の実験をスムーズに行えるものと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、多少の研究計画の変更はあるものの順調に進んでおり、次年度以降も予定通りに実施できるものと思われる。次年度では、（1）バイオフィルム感染症モデルマウスの作成と高分子ナノ粒子製剤を投与したマウスの評価、（2）複数菌から形成されたバイオフィルムに対する高分子ナノ粒子製剤の抗菌活性評価、（3）バイオフィルム感染症治療を目的とする高分子ナノ粒子キャリアの最適化の3つの研究を実施して行く。今年度に実施が難しかったバイオフィルム感染症モデルマウス作成の実験は、研究協力者の山本教授の協力により実施する。このバイオフィルム感染症モデルマウスを用いて、これまで作製した高分子ナノ粒子製剤がどの程度抗菌活性を発揮可能であるか評価する。本年度に試みた表皮ブドウ球菌以外の菌を用いたバイオフィルムの形成法を取り入れ、複数菌を用いたバイオフィルム形成を試みる。この複数菌から形成されたバイオフィルムに対する高分子ナノ粒子製剤の抗菌活性評価を従来の評価法と本年度までに確立した評価法（イオン液体を試料前処理に用いた手法と透過型電子顕微鏡にカソードルミネッセンスを組み込んだ手法）により実施する。透過型電子顕微鏡にカソードルミネッセンスを組み込んだ手法の確立については、研究協力者である武藤教授の協力により実施する。上記のように実施した評価結果から、実用化が可能な薬物送達用ナノ粒子キャリアを設計する。この設計したナノ粒子の効能は、上記の評価法で再度確認する。
得られた成果は、随時、論文および学会にて発表する予定である。
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| Causes of Carryover |
今年度に計画していた実験を一部変更したため、当初の金額より少ない使用額になった。（モデルマウス作成のための費用など）
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度に実験計画を変更したモデルマウス作成とモデルマウスを用いた評価を次年度に実施する。
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[Journal Article] Imaging of intracellular behavior of polymeric nanoparticles in Staphylococcus epidermidis biofilms by slit-scanning confocal Raman microscopy and scanning electron microscopy with energy-dispersive X-ray spectroscopy.2017
Author(s)
Takahashi, C., Ueno, K., Aoyama, J., Adachi, M.., Yamamoto, H.
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Journal Title
Mater. Sci. Eng. C,
Volume: 印刷中
Pages: 印刷中
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Visualization of silver-decorated poly (DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles and their efficacy against Staphylococcus epidermidis.2017
Author(s)
Takahashi, C., Matsubara, N., Akachi, Y., Ogawa, N., Golap, K., Asaka, T., Tanemura, M., Kawashima, Y., Yamamoto, H.
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Journal Title
Mater. Sci. Eng. C,
Volume: 72
Pages: 143-149
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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