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2015 Fiscal Year Research-status Report

クロマチン構造変換複合体によるRNAポリメラーゼII転写開始複合体の制御機構

Research Project

Project/Area Number 15K18861
Research InstitutionUniversity of Toyama

Principal Investigator

田中 亜紀  富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 助教 (50432109)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords基本転写因子 / TFIIE / RNAポリメラーゼ clamp
Outline of Annual Research Achievements

本研究ではクロマチン構造変換複合体であるSWI/SNF複合体が基本転写因子TFIIEを介してRNAポリメラーゼII(Pol II)の転写開始複合体を制御して、転写を活性化しているのかを解明することを目指す。本年度の研究計画である「ヒトTFIIEα ウイングドヘリックス(WH)領域の変異体とPol IIのclampとの結合実験により相互作用領域を同定する」に関しては、GSTタグ融合ヒト組換え体clampを作成してGST pull-downアッセイを行った。その結果TFIIEだけでなく、TFIIBおよびDSIFが結合した。Pol IIのclampはその活性を発揮するために構造変化が大きい領域であり、転写を開始するときにはPol IIがDNAを挟み込みやすくするためにclampにTFIIEが結合し、転写伸長のときにはclampに転写伸長因子DSIFが結合してPol IIがDNAを安定に挟むことを助けていると考えられている。今回の実験では新たに転写開始位置の決定や伸長への移行に関わるTFIIBもclampに強く結合することが分かった。またclampに対してTFIIEとTFIIBは協調的に結合する一方で、TFIIEとDSIFは競合的に結合した。これまでの我々の研究でTFIIEとTFIIBは協調的に転写開始から伸長への移行段階を制御していることを報告しており、今回の結果を含めるとPol IIのclampを介した機能である可能性が示唆された。一方「TFIIHによるTFIIEαのリン酸化およびin vitro転写アッセイにより転写活性を評価する」に関しては、TFIIEの欠失変異体を用いたin vitroリン酸化アッセイによりTFIIEのリン酸化領域を同定した。今後はこのリン酸化修飾がPol IIのclampにおけるTFIIEとDSIFの入れ替わりに関わるのかを解析する。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究ではヒトTFIIEα ウイングドヘリックス(WH)領域が、(1)PICで転写を活性化させる分子機構、(2)SWI/SNF複合体との相互作用を介して転写を活性化させる分子機構の二方面から解析を進める計画である。(1)に関しては、TFIIEとTFIIBが協調的に、Pol IIのclampを介して転写開始から伸長への移行の制御に関わる可能性を示す結果が得られており、おおむね順調に進展している。さらにTFIIEとDSIFのclampにおける入れ替わりを、それらの因子のリン酸化等の翻訳後修飾による制御を含めて解析を進める準備が整いつつある。一方(2)に関しては、SWI/SNF複合体とTFIIEαの結合が見られており、TFIIEα WH領域がSWI/SNF複合体との相互作用に関わる可能性を示せている。本年度は、SWI/SNF複合体のサブユニットに対するsiRNA法によるノックダウンした細胞抽出液を用いて、TFIIEとの相互作用に関わるサブユニットを同定する計画であったが、SWI/SNF複合体のどのサブユニットが関わるのかを示すことができていない。さらに実験条件の検討を進めるが、TFIIEが結合するSWI/SNF複合体のサブユニットを同定できない場合は、TFIIEα側の相互作用に関わるアミノ酸を同定して、そのアミノ酸の変異体を用いて転写活性の評価を進めることとする。

Strategy for Future Research Activity

TFIIEを介したPol IIの活性制御機構の解析に関しては、Pol IIのclampに対してTFIIEとTFIIBは協調的に結合する一方で、TFIIEとDSIFは競合的に結合することが示された。ClampにおけるTFIIEとDSIFの入れ替わりにTFIIBが与える影響を調べる。またこれらの因子が鋳型DNA上での転写活性に与える影響を調べるために、immobilized templateアッセイによりタンパク間相互作用や転写活性の評価を行う。さらに転写過程においてTFIIH, メディエーター複合体, pTEFbのキナーゼ活性が重要であることが知られている。また我々が行った実験においてもTFIIEはTFIIHによりリン酸化されることから、このリン酸化修飾が、Pol IIのclampにおけるTFIIEとDSIFの入れ替わりに影響を与えるのか、TFIIE以外の因子のリン酸化修飾の影響を含めて検討する。一方、TFIIEとSWI/SNF複合体による転写活性化機構の解析に関しては、TFIIEの変異体を用いてSWI/SNF複合体との相互作用領域を同定し、in vitro転写アッセイによる転写活性の評価を行う。またクロマチン免疫沈降法によりTFIIEとSWI/SNF複合体のDNA上での局在を解析する。

Causes of Carryover

本研究ではヒトTFIIEα ウイングドヘリックス(WH)領域が、(1)PICで転写を活性化させる分子機構、(2)SWI/SNF複合体との相互作用を介して転写を活性化させる分子機構の二方面から解析を進める計画であるが、(2)に関して当初の計画通りに解析が進まず、解析に必要な試薬類等の出費が抑えられたためである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度では、本年度に達成できなかったSWI/SNF複合体のサブユニットに対するsiRNA法によるノックダウンした細胞抽出液を用いたTFIIEとの相互作用サブユニットの同定を、再度条件検討を行うとともに、TFIIEα側の相互作用に関わるアミノ酸を同定して、そのアミノ酸の変異体を用いて転写活性の評価を進めることとする。これにより計画当初の目的の達成を目指す。

  • Research Products

    (10 results)

All 2015

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (8 results)

  • [Journal Article] Association of the winged helix motif of the TFIIEα subunit of TFIIE with either the TFIIEβ subunit or TFIIB distinguishes its functions in transcription.2015

    • Author(s)
      Tanaka A, Akimoto Y, Kobayashi S, Hisatake K, Hanaoka F, Ohkuma Y.
    • Journal Title

      Genes to Cells

      Volume: 20 Pages: 203-216

    • DOI

      10.1111/gtc.12212.

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Human mediator MED17 subunit plays essential roles in gene regulation by associating with the transcription and DNA repair machineries.2015

    • Author(s)
      Kikuchi Y, Umemura H, Nishitani S, Iida S, Fukasawa R, Hayashi H, Hirose Y, Tanaka A, Sugasawa K, Ohkuma Y.
    • Journal Title

      Genes to Cells

      Volume: 20 Pages: 191-202

    • DOI

      10.1111/gtc.12210.

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] CpGオリゴ核酸によるTLR9を介した転写制御機構の解析2015

    • Author(s)
      山本誠司,萩原衆子,堀内祥行,奥井文,和仁翔太郎, 吉田徳幸, 井上貴雄, 田中亜紀, 松久明生,廣瀬豊, 大熊芳明
    • Organizer
      BMB2015 第38回日本分子生物学会・第88回日本生化学会合同年会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [Presentation] 基本転写因子TFIIBとTFIIEによる転写開始の制御機構2015

    • Author(s)
      中村考秀、田中亜紀、秋元勇亮、郭丹恵、大熊芳明
    • Organizer
      BMB2015 第38回日本分子生物学会・第88回日本生化学会合同年会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [Presentation] 基本転写因子TFIIEα winged helix領域の機能解析2015

    • Author(s)
      田中亜紀、福岡瑞希、小林聡子、大熊芳明
    • Organizer
      BMB2015 第38回日本分子生物学会・第88回日本生化学会合同年会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [Presentation] ヒトメディエーター複合体hMED17サブユニットによる転写制御とDNA損傷修復機能の解明2015

    • Author(s)
      菊地祐子, 西谷紗織, 梅村啓靖, 田中亜紀, 廣瀬豊, 菅澤薫, 大熊芳明
    • Organizer
      BMB2015 第38回日本分子生物学会・第88回日本生化学会合同年会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [Presentation] 転写コファクターPC4と基本転写因子TFIIEのβサブユニットとの協調的な働き2015

    • Author(s)
      秋元勇亮, 山本誠司, 飯田智, 田中亜紀, 廣瀬豊, 大熊芳明
    • Organizer
      BMB2015 第38回日本分子生物学会・第88回日本生化学会合同年会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [Presentation] 基本転写因子TFIIEによる転写開始から伸長への移行の制御機構解析2015

    • Author(s)
      中村考秀, 田中亜紀, 廣瀬豊,大熊芳明
    • Organizer
      日本薬学会北陸支部第127回例会
    • Place of Presentation
      富山
    • Year and Date
      2015-11-15
  • [Presentation] メディエーター複合体と転写因子BRD4との機能的関連性の検討2015

    • Author(s)
      林裕人、田中亜紀、廣瀬豊、田渕明子、大熊芳明.
    • Organizer
      第33回日本生化学会北陸支部例会
    • Place of Presentation
      富山
    • Year and Date
      2015-05-23
  • [Presentation] 基本転写因子TFIIEによる転写開始と伸長の制御機構の解析2015

    • Author(s)
      郭丹慧、保田幸子、廣瀬豊、田中亜紀、今中常雄、大熊芳明.
    • Organizer
      第33回日本生化学会北陸支部例会
    • Place of Presentation
      富山
    • Year and Date
      2015-05-23

URL: 

Published: 2017-01-06  

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