2016 Fiscal Year Research-status Report
上皮成長因子受容体変異体vIII発現細胞の分子標的薬リード創製と作用機序解明
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15K18904
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| Research Institution | Microbial Chemistry Research Foundation |
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Principal Investigator |
木村 智之 公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 研究員 (40462270)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 構造活性相関 / 分子標的 / 上皮成長因子受容体変異体vIII / 作用機序解明 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度の構造活性相関研究の成果をもとに、標的分子の解明を目的としたErtredinプローブの合成、その活性評価、MALDI TOF MSによる特異バンドの解析を行った。
はじめに、活性を保持したErtredinプローブの合成を目指した。昨年度の構造活性相関研究の結果から、アミン部をアシル化しても活性が保持されることが判明しており、アミン部を足掛かりにして、プローブ化を行うことにした。活性を保持したプローブを作製するために、ビオチンタグ、光親和性タグの位置を変えるために、アスパラギン酸などのアミノ酸、様々な長さのPEGなどを用いて検討を行った。同時に、東京医科歯科大細谷らにより開発された、ジアジドプローブ法の適用も試みた。更に、特異バンドの判定を確かなものにするため、昨年度の構造活性相関研究から、不活性な誘導体を選び、inactiveプローブを合成した。これら二つのプローブを用いることにより疑似陽性のバンドを排除することができると考えた。検出されたバンドは、所内のMALDI TOF MSにて解析を行った。
これまで、活性評価は、Ertredinを見出す際に用いたマウス由来のNIH3T3細胞を用いて行ってきた。「ヒト」の抗がん剤のリード化合物とすべく、本年度末より、ヒト肺胞基底上皮腺がん細胞A549の評価系も立ち上げ、二つの評価系を用いて化合物の活性を評価した。
これまでに得られた構造活性相関研究について、137回日本薬学会年会にて「上皮成長因子受容体変異体vⅢ発現細胞の足場非依存性増殖阻害活性を有する低分子化合物の構造活性相関研究」というタイトルでにて口頭発表を行った。また、これまで合成した化合物の活性と活性試験結果を系統ごとにまとめた論文を執筆中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度の大きな目的である標的タンパク質の同定に向けて誘導体展開を行った。昨年度の構造活性相関研究の結果から、アミン部をアシル化しても活性が保持されることが判明しており、アミン部を足掛かりにして、プローブ化を行うことにした。活性を保持したプローブ合成の知見を得るために、昨年度はアルキル鎖の長さでビオチンタグの位置を調整していたが、本年度はその知見をもとに、プローブの溶解性向上、並びに結合サイトがタンパク質の奥にある場合も想定してErtredinとビオチンタグの距離をより長くすることを考え、長さが異なるPEGを用いて距離を調製するとともに、光親和性タグの位置を変えるために、アスパラギン酸などのアミノ酸の検討を行った。合成した誘導体はすべて、所内で常時稼働しているNIH3T3細胞を用いた評価系にて、その活性を評価し、活性を保持したプローブの創生を行った。また更に、特異バンドの判定を確かなものにするため、昨年度の構造活性相関研究から、不活性な誘導体を選び、inactiveプローブを合成した。これにより疑似陽性のバンドの排除を行った。検出されたバンドについて、所内のMALDI TOF MSを用いてプロテオーム解析を行った。しかしながら現在のところ、標的タンパクの同定には至らなかった。
また、その他のプローブとして東京医科歯科大細谷らにより開発された、ジアジドプローブ法の適用も試みた。ジアジドタグ部分とErtredinをアルキル鎖で結合させたが、プローブ自体の溶解度が下がってしまい、NIH3T3評価系でその活性を測定したところ、活性の大幅な低下がみられ、本誘導体の標的タンパク質同定試験への使用を断念した。
本年度末より、ヒト肺胞基底上皮腺がん細胞A549の評価系も立ち上げ、多角的に化合物の活性を評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
作用機序解明のために標的タンパク質の同定を進める。蛍光基を導入した誘導体を用いて、細胞内のどこに集積するか観察し、範囲をより狭めてプローブ法を試みることを考えている。また、プローブ法を用いた化学的手法が困難である場合は、遺伝子発現（DNA マイクロアレイ使用→クラスタ解析→Connectivity Map 照会）、蛋白リン酸化（2次元電気泳動とリン酸化蛋白染色）の網羅的解析からこれを特定し作用点を探る試みを強化する。標的タンパク質が決まることにより既知化合物立体構造データベースZINCなどを用いたシミュレーションが行え、より効率的な誘導体展開を行うことができるので、注力していきたいと考えている。
新たに立ち上げた、ヒト肺胞基底上皮腺がん細胞A549を用いた評価系において、これまで用いていたマウス由来のNIH3T3細胞系の評価系と、構造活性相関のパターンが若干異なることが、これまでの研究で明らかになった。これは、細胞種による感受性の違いもあるが、本化合物の作用機序、あるいは標的タンパク質の構造の違いにより活性発現に違いが出ている可能性がある。今後は、両評価系を使用するとともに、A549細胞の評価系により注視して構造活性相関研究を展開し、「ヒト」の腫瘍に効果がある化合物の創生を行うことを考えている。また、誘導体展開の方向性を決めるために、NIH3T3及びA549細胞評価系にて強い活性を示した化合物は、A549細胞を移植したモデルマウスを用いた治療実験で活性の評価を行うことを計画している。この評価により、既存の治療薬と比較しての力価の評価、in vitroの評価系ではわからなかった副作用の有無など、多くの情報が得られ、更なる開発につながると考えている。
標的タンパク質の同定並びにin vivo活性試験からの両方から、より高活性で安全な抗腫瘍物質の創生を目指すことを考えている。
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| Causes of Carryover |
標的タンパク質同定分野で若干遅れが生じ、それ以外の分野はおおむね順調に研究が行われているが、若干の繰越金が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
活性試験に使用する細胞培養にかかる消耗品、化学実験に使う真空ポンプの購入に充てる。
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