マーモセット薬物代謝酵素チトクロムP450 2C分子種の機能および多型性解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K18934
• Research Institution: Showa Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 上原 正太郎 昭和薬科大学, 薬学部, 特任助教 (10733123)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: P450 / Marmoset

Outline of Annual Research Achievements

マーモセットP450 2C8, 2C18, 2C19, 2C58, および2C76のmRNAは、調べた5組織（脳、肺、肝臓、腎臓および小腸）のうち、いずれも薬物代謝に重要である肝臓で高い発現を示し、ヒトP450 2C分子種の発現分布とよく似た特徴を示した。5種のマーモセットP450 2C分子種は対応するヒトP450 2C分子種に対してアミノ酸レベルで86%以上の高い相同性を示し、その組換え酵素は典型的なヒトP450 2C指標活性を示した。特にマーモセットP450 2C19はワルファリン、トルブタミド、フルルビプロフェンおよびオメプラゾールなどの多くのヒトP450 2C9/19基質を効率よく代謝した。代表的なキラル薬物であるワルファリンの肝P450による酸化的代謝はヒトとカニクイザルで種差が認められているが、マーモセットはP450 2C19を介してS体選択的であり、その立体選択性にヒトとよく似た特徴が認められた。in vivo投与実験でS-ワルファリンの血中消失が遅かったマーモセット個体のP450 2C19遺伝子配列を調べたところ、3つの非同義置換変異（Phe7Leu, Ser254Leu, Ile469Thr）を見出した。Ser254Leuを持つP450 2C19組換え酵素は野生型P450 2C19と比較して著しくワルファリン7-水酸化活性が低下することからSer254LeuはマーモセットのP450 2C依存的な薬物代謝の個体差の一因となっていることが推察された。加えて、マーモセットP450 1A1,1A2, 1B1, 2A6, 2D6, 2D8, 2J2, 3A4, 3A5, 3A90についてもヒトP450との酵素学的性質の相同性および相違性を明らかにした。これらの知見はマーモセットを用いて創薬研究を行う際の基盤情報となる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

27-28年度計画の新規マーモセットP450 2C 分子種の機能解析に関する6つの項目のうち5つを実施しており、計画通り研究が進展している。詳しく述べると、マーモセットP450 2C 遺伝子発現の臓器特異性および主要発現臓器におけるタンパク質の検出は終了し、マーモセット組換えP450 2C 酵素を用いた薬物代謝能の評価については限られた少ない薬物のみではあるが、マーモセットP450 2C酵素がヒトP450 2C指標基質を代謝することを報告できた。さらにP450 2C19遺伝子多型の検出および組換え変異型P450 酵素を用いた解析を行い、マーモセット個体の薬物代謝能にP450 2C遺伝子多型が影響することを報告した。未報告であるマーモセットP450 2C 分子種の誘導能の評価についても現在進行中である。

Strategy for Future Research Activity

マーモセット組換えP450 2C 酵素を用いた薬物代謝能の評価について、これまで少数の典型的なヒトP450 2C基質を中心に解析を進めてきたが、P450 2C19以外のP450 2C8, 2C18, 2C58および2C76については解析が不十分である。さらに多く薬物を用いて詳細な機能解析を行い、マーモセットP450 2C酵素の基質特異性を明らかにする。
マーモセットP450 2C 分子種の誘導能の評価については未実施であるが、市販のマーモセット凍結肝細胞を2ロット確保できたのでヒト凍結肝細胞による酵素誘導の十分な情報がある典型的なヒトP450 阻害剤に対する応答性を明らかにする。
マーモセットP450 2C 遺伝子多型解析については現在P450 2C19のみ実施した。P450 2C19以外のP450 2C分子種についても、組換えP450酵素を用いた機能解析により種差あるいは個体差に重要であると考えられた場合、遺伝子多型解析を実施する。

Causes of Carryover

研究を誠実に予定通り実施した結果、実際に使用した研究費が年度当たり研究費予定額を下回ってしまい、研究費に残余額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度に実施する「マーモセット組換えP450 2C 酵素を用いた薬物代謝能の評価」に必要な試薬を購入する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Human plasma concentrations of cytochrome P450 probe cocktails extrapolated from pharmacokinetics in mice transplanted with human hepatocytes and from pharmacokinetics in common marmosets using physiologically based pharmacokinetic modeling. (2016)
  • Author(s): Utoh, M., Suemizu, H., Mitsui, M., Kawao, M., Toda, A., Uehara, S., Uno, Y., Shimizu, M., Sasaki, E., and Yamazaki, H.
  • Journal Title: Xenobiotica Volume: 46 Pages: 1049-1055
  • DOI: 10.3109/00498254.2016.1147102
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Simultaneous pharmacokinetics evaluation of human cytochrome P450 probes, caffeine, warfarin, omeprazole, metoprolol, and midazolam, in common marmosets (Callithrix jacchus). (2016)
  • Author(s): Uehara, S., Inoue, T., Utoh, M., Toda, A., Shimizu, M., Uno, Y., Sasaki, E., and Yamazaki, H.
  • Journal Title: Xenobiotica Volume: 46 Pages: 163-168
  • DOI: 10.3109/00498254.2015.1057270.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Caffeine 7-N-demethylation and C-8-oxidation mediated by liver microsomal cytochrome P450 enzymes in common marmosets. (2016)
  • Author(s): Uehara, S., Uno, Y., Inoue, T., Suzuki, T., Utoh, M., Sasaki, E., and Yamazaki, H.
  • Journal Title: Xenobiotica Volume: 46 Pages: 573-578
  • DOI: 10.3109/00498254.2015.1096980
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Molecular cloning, tissue distribution, and functional characterization of marmoset cytochrome P450 1A1, 1A2, and 1B1. (2016)
  • Author(s): Uehara, S., Uno, Y., Inoue, T., Sasaki, E., and Yamazaki, H.
  • Journal Title: Drug Metab. Dispos. Volume: 44 Pages: 8-15
  • DOI: 10.1124/dmd.115.067561.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Marmoset cytochrome P450 2J2 mainly expressed in small intestines and livers effectively metabolizes human P450 2J2 probe substrates, astemizole and terfenadine. (2016)
  • Author(s): Uehara, S., Uno, Y., Inoue, T., Okamoto, E., Sasaki, E., and Yamazaki, H.
  • Journal Title: Xenobiotica Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A new marmoset P450 4F12 enzyme expressed in small intestines and livers efficiently metabolizes an anti-histaminic drug ebastine. (2016)
  • Author(s): Uehara, S., Uno, Y., Yuki, Y., Inoue, T., Sasaki, E., and Yamazaki, H.
  • Journal Title: Drug Metab. Dispos. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Individual differences in metabolic clearance of S-warfarin efficiently mediated by polymorphic marmoset cytochrome P450 2C19 in livers. (2016)
  • Author(s): Uehara, S., Uno, Y., Inoue, T., Kawano, M., Shimizu, M., Toda, A., Utoh, M., Sasaki, E., and Yamazaki, H.
  • Journal Title: Drug Metab. Dispos. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Marmoset cytochrome P450 2D8 in livers and small intestines metabolizes typical human P450 2D6 substrates, metoprolol, bufuralol, and dextromethorphan. (2015)
  • Author(s): Uehara, S., Uno, Y., Hagihira, Y., Murayama, N., Shimizu, M., Inoue, T., Sasaki, E., and Yamazaki, H.
  • Journal Title: Xenobiotica Volume: 45 Pages: 757-765
  • DOI: 10.3109/00498254.2015.1019595.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Activation and deactivation of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) by cytochrome P450 enzymes and flavin-containing monooxygenases in common marmosets (Callithrix jacchus). (2015)
  • Author(s): Uehara, S., Uno, Y., Inoue, T., Murayama, N., Shimizu, M., Sasaki, E., and Yamazaki, H.
  • Journal Title: Drug Metab. Dispos. Volume: 43 Pages: 735-742
  • DOI: 10.1124/dmd.115.063594.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Substrate selectivities and catalytic activities of marmoset liver cytochrome P450 2A6 differed from those of human P450 2A6. (2015)
  • Author(s): Uehara, S., Uno, Y., Inoue, T., Sasaki, E., and Yamazaki, H.
  • Journal Title: Drug Metab. Dispos. Volume: 43 Pages: 969-976
  • DOI: 10.1124/dmd.115.063909
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel marmoset cytochrome P450 2C19 in livers efficiently metabolizes human P450 2C9 and 2C19 substrates, S-warfarin, tolbutamide, flurbiprofen, and omeprazole. (2015)
  • Author(s): Uehara, S., Uno, Y., Inoue, S., Kawano, M., Shimizu, M., Toda, A., Utoh, M., Sasaki, E., and Yamazaki, H.
  • Journal Title: Drug Metab. Dispos. Volume: 43 Pages: 1408-1416
  • DOI: 10.1124/dmd.115.066100.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] マーモセットあるいはカニクイザル肝細胞を用いた薬物暴露によるチトクロムP450誘導の評価 (2016)
  • Author(s): 鈴木貴子, 上原正太郎, 村山典恵, 宇野泰広, 矢島加奈子, 鵜藤雅裕, 井上貴史, 佐々木えりか, 山崎浩史
  • Organizer: 日本薬学会第136年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県・横浜市)
  • Year and Date: 2016-03-26 – 2016-03-29
• [Presentation] マーモセット肝のワルファリン酸化的代謝の立体選択性 (2016)
  • Author(s): 河野未来, 上原正太郎, 石井さくら, 宇野泰広, 井上貴史, 鵜藤雅裕, 佐々木えりか, 山崎浩史
  • Organizer: 日本薬学会第136年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県・横浜市)
  • Year and Date: 2016-03-26 – 2016-03-29
• [Presentation] 新規マーモセットP450 2J酵素の同定および機能解析 (2016)
  • Author(s): 上原正太郎, 岡本絵里子, 宇野泰広, 井上貴史, 佐々木えりか, 山崎浩史
  • Organizer: 日本薬学会第136年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県・横浜市)
  • Year and Date: 2016-03-26 – 2016-03-29
• [Presentation] マーモセットおよびカニクイザル小腸P450酵素によるエバスチン酸化的代謝 (2016)
  • Author(s): 上原正太郎, 結城友香子, 宇野泰広, 井上貴史, 佐々木えりか, 山崎浩史
  • Organizer: 日本薬学会第136年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県・横浜市)
  • Year and Date: 2016-03-26 – 2016-03-29
• [Presentation] ヒト肝細胞移植マウスおよびマーモセット生理学的薬物動態モデルを活用したチトクロムP450カクテル基質のヒト血中濃度推移予測 (2016)
  • Author(s): 清水万紀子, 三井満里奈, 河野未来, 上原正太郎, 宇野泰広, 鵜藤雅裕, 井上貴史, 佐々木えりか, 末水洋志, 山崎浩史
  • Organizer: 日本薬学会第136年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県・横浜市)
  • Year and Date: 2016-03-26 – 2016-03-29
• [Presentation] Cytochrome P450-dependent warfarin and caffeine metabolism in marmosets, monkeys, and humans. (2015)
  • Author(s): Hiroshi Yamazaki, Shotaro Uehara, Yasuhiro Uno, and Erika Sasaki
  • Organizer: 20th North American ISSX Meeting
  • Place of Presentation: Hilton Orlando Bonnet Creek (Orlando, USA）
  • Year and Date: 2015-10-18 – 2015-10-22
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] マーモセット肝のワルファリン代謝の解析 (2015)
  • Author(s): 河野未来, 上原正太郎, 宇野泰広, 鵜藤雅裕, 佐々木えりか、山崎浩史
  • Organizer: 第59回日本薬学会関東支部大会
  • Place of Presentation: 日本大学薬学部（千葉県・船橋市）
  • Year and Date: 2015-09-12
• [Presentation] マーモセット肝のカフェイン代謝経路の解析 (2015)
  • Author(s): 鈴木貴子, 上原正太郎, 宇野泰広, 鵜藤雅裕, 佐々木えりか, 山崎浩史
  • Organizer: 第59回日本薬学会関東支部大会
  • Place of Presentation: 日本大学薬学部（千葉県・船橋市）
  • Year and Date: 2015-09-12
• [Presentation] Cytochrome P450-dependent xenobiotic metabolism in marmosets (2015)
  • Author(s): Shotaro Uehara, Hiroshi Yamazaki
  • Organizer: 2nd Symposium of SPU Innovative Project for Pharmaceutical Analyses of Covalent Modification in Biomolecules
  • Place of Presentation: 昭和薬科大学(東京都・町田市)
  • Year and Date: 2015-08-31 – 2015-09-01
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Molecular cloning, expression and functional characterization of marmoset cytochrome P450 2A6. (2015)
  • Author(s): Shotaro Uehara, Yasuhiro Uno, Norie Murayama, Makiko Shimizu, Hiroshi Yamazaki
  • Organizer: 19th International Conference on Cytochrome P450
  • Place of Presentation: 国立オリンピック記念青少年総合センター(東京都・代々木)
  • Year and Date: 2015-06-12 – 2015-06-15
  • Int'l Joint Research