2016 Fiscal Year Research-status Report
Investigating the role of a conventional marker protein in ORNs
| Project/Area Number |
15K18967
|
|---|
| Research Institution | Kurume University |
|---|
Principal Investigator |
中島 則行 久留米大学, 医学部, 助教 (80625468)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 結合蛋白 / セカンドメッセンジャー / イオンチャネル |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
OMPは、嗅細胞のマーカーとして一般的に利用されているにもかかわらず、その生理学的な役割の多くは不明である。OMPノックアウト（KO）マウスを用いた実験で、cAMP感受性CNGチャネルが閉じにくくなるなど、cAMPとの関連を示唆する所見が散見される。刺激に応じて産生されたcAMPに対して、OMPはどのような制御を示すのかを明らかにした。具体的には、cAMP濃度依存的に素早く開くCNGチャネルを培養細胞に発現させ、同時にパッチクランプすることでcAMP感受性センサーとして用いて電流を計測した。この培養細胞にCNGチャネルとOMPを共発現させて、今回の実験系とした。ここにさらにアドレナリンβ１受容体を発現させた。イソプロテレノールを局所投与し、細胞内cAMPを上昇させた。電位固定パッチクランプ法により、CNGチャネル応答電流の変化として計測した。CNGチャネル電流は、OMPの非存在下においては、緩やかに活性化し、一定レベルで定常状態を示す。OMPの野生型の存在下ではCNG電流は速やかに脱感作されるが、OMPの変異体が存在していると脱感作は見られなかった。これより、OMPはcAMPと結合することでセカンドメッセンジャーのホメオスタシスを制御していることが考えられる。免疫組織学を用いた実験により、OMPは、脳の広い部分に存在することが分かってきている。とくに間脳において発現が強かった。もともと神経新生をする嗅細胞において発現しているため、間脳でもBrdU神経新生染色を試みた。するとOMPが神経細胞の一部で発現していることが分かった。この結果は、OMP遺伝子座にGFPをノックインしたマウスでも確かめられた。今後はOMPと神経新生の関連を検索していく予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の目標通り、生化学実験によりOMPとcAMPとの結合定数をおおよそ求めることができた。さらに、その他のヌクレオチドとの相対的な結合強度も比較することができた。生体内での働きとして、イオンチャネルとの相互作用が再現できた。免疫染色法にて全身にわたり検索をした結果、新生神経細胞や感覚上皮などでOMPを発現している細胞があることが明らかになった。
一方で、実際に単離・スライス嗅神経を用いた実験は遂行することができなかったが、OMPが嗅細胞以外の細胞でも普遍的な機能を持ちうることが示唆される結果を得たため、当初の予定とは異なったものの今後の新知見につながる結果が得られたと考える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究で、OMPが新生神経、新生細胞において一時的に発現していることが示唆される。つまり神経の発達・新生のステージでの役割が示唆される。cAMPはセカンドメッセンジャーとして普遍的に利用されるため、産生量・産生時期・産生部位などで機能が分かれる。OMPは、その過程に作用すると考える。今回、新たに神経新生とOMPの関係が示唆された間脳をターゲットにする。そこで、OMP発現部位でGFPを発現するノックアウトマウス（OMP-GFPマウス）を用いて神経新生の投射部位や間脳内の核の種類を明らかにする。間脳は、自律調節の中枢が集中しているため、OMP-GFPマウスで自律機能の変化が起こっていないか、体温、摂食、睡眠に注目して検索を進める。
|
| Causes of Carryover |
理研からのマウスの購入費用が予定より安価であったこと、細胞刺激用のセットアップを自作することで、支出が抑えられたことによる。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今後は、論文の投稿に当たり、校正費・投稿費に一部を使用する。また、In vivoでマウスの脳内から神経記録を得るために、脳定位装置もしくはマイクロマニピュレータを使用予定のため、残りはその購入に充てる予定である。
|
