2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K18996
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
小堀 宅郎 近畿大学, 医学部, 助教 (60734697)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | マクロファージ / 血管新生 / オステオポンチン / 炎症性メディエーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
・Interleukin (IL)-18は主にマクロファージから分泌され、関節リウマチ（RA）等の慢性炎症性疾患の微小環境において血管新生を促進するが、その詳細な機構は不明である。これまでに我々は、IL-18がマクロファージのM2分化とその血管新生作用を増強することを明らかにしてきた。さらに本機構に関与する因子を網羅的に解析した結果、RA患者において発現が著明に増加する細胞外マトリックスタンパク質の一つであるオステオポンチン（OPN）を見出した。OPNはマクロファージを含め多種多様な細胞から分泌されるが、マクロファージ分化への影響については不明である。そこで本年度は、IL-18によるマクロファージM2分化および血管新生増強機構におけるOPNの関与について検討した。
・マウス由来単球細胞のRAW264.7細胞を用い、IL-10刺激によってM2型マクロファージへと分化させた。細胞表面のM2マーカー（CD163）発現量は、flow cytometryで測定した。マクロファージの血管新生作用は、マウス由来血管内皮細胞のb.End5細胞との共培養によるin vitro matrigel tube formation assayで解析した。
・IL-10とIL-18の併用刺激は、IL-10単独刺激と比較して、RAW264.7細胞表面におけるCD163発現量ならびにb.End5細胞との共培養による管腔面積および管腔長をいずれも有意に増加させた。これらの作用は、抗マウスOPN抗体をサイトカインと同時処置することにより有意に抑制された。さらに、マクロファージに高発現するOPN受容体（インテグリンα4またはα9）に対する中和抗体を用いた場合にも同様の結果が観察された。したがって、OPNはIL-18によるマクロファージM2分化ならびに血管新生増強作用において、重要な役割を果たす可能性が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
・申請時の実験計画に対するこれまでの研究成果の到達度：
①サイトカイン刺激によるマクロファージ表面抗原発現の変化（到達率：100%）、②サイトカイン刺激によるマクロファージの血管形成能の変化（到達率：100 %）：Th1サイトカインのTNF-αまたはTh2サイトカインのIL-10等を用い、M1/M2型マクロファージへの分化誘導評価系を確立することに成功し、さらにIL-18等の炎症性メディエーターが本機構を増幅することを見出した。また、M2マクロファージによる血管新生促進作用を評価するin vitro実験系を確立し、IL-18がその作用機構を増強することを明らかにした。④癌局所におけるマクロファージ表面抗原とHMGB-1の発現解析（到達率：50%）：雌性BALB/cマウスの皮下にマウス結腸癌細胞株をxenograftし、担癌モデルマウスを作成した。さらにxenograft後に浸透圧ポンプから抗HMGB-1抗体を持続投与した結果、control抗体投与群と比較して癌組織容積が縮小することを見出している。⑤サイトカイン刺激によるマクロファージ表面抗原と血管形成作用の変化に対するHMGB-1併用刺激の影響（到達率：50%）：予備実験により、TNF-αまたはIL-10によるM1/M2型マクロファージへの分化作用に対して、HMGB-1の同時処置がいずれの作用をも増幅する知見を得ている。
・下記の研究内容は申請時の計画通り、平成29年度に実施予定である。
③マトリゲル中の血管形成および周辺組織のマクロファージ表面抗原発現の解析
⑥HMGB-1による血管新生誘導作用に関与する受容体の特定
なお、申請当初は想定していなかったIL-18によるマクロファージM2分化増強および血管新生促進機構に関与する因子としてOPNを同定することに成功したため、さらに詳細なメカニズムの解析をあわせて進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度までに確立した実験評価系を用い、HMGB-1 がマクロファージの M1/M2 分化あるいは M1/M2 分化の増強機構のいずれに影響を及ぼすかについて、flow cytometry で解析する。同様に、HMGB-1 で分化させたマクロファージと血管内皮細胞を共培養し、管腔形成の変化を in vitro matrigel tube formation assay で評価する予定である。また、新たに in vivo 実験系として、担がんマウスの腫瘍周辺組織に集簇したマクロファージのフェノタイプの解析や HMGB-1 の発現・局在解析を進めたい。さらに、HMGB-1 の発現調節あるいはマクロファージ M1/M2 分化増強機構に関与する因子の探索も行いたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
研究の進展に伴い、当初は予想し得なかった新たな知見が得られたことから、その知見を使用し十分な研究成果を得るために、研究計画を変更する必要が生じた。これによって、その調節に予想以上の日数を要したため、平成 28 年度内に完了することが困難となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成 28 年度内に完了することが困難となった実験を平成 29 年度の早々に行う用意が整ったため、M2 マクロファージによる血管新生に関与する因子の特定を目的として、in vitro matrigel tube formation assay にて標的因子の生理活性を阻害するために必要な中和抗体等の購入に繰越額を用いる予定である。
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Research Products
(2 results)
