2015 Fiscal Year Research-status Report
生体内enChIP法を用いたシチジンデアミナーゼ遺伝子発現調節機構の解明
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15K19005
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
佐藤 克哉 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60733508)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | AID / 遺伝子発現調節 / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Activation induced cytidine deaminase (AID) は、活性化に伴い、Bリンパ球に強く発現し、体細胞超変異やクラススイッチ組み換えを引き起こす。これにより、高親和性の種々のクラスの抗体を生産できるようになる。AID遺伝子 (Aicda) の発現の有無や、発現レベルの程度は、細胞系列や周囲からの刺激に連動した複数の転写調節因子により、複雑に制御されていると考えられる。本研究では、CRISPR/dCas9を用いたenChIP等の手法を活用し、Aicda領域に結合する転写調節因子や、転写因子―DNA複合体の構造をBリンパ球や、他の様々な細胞において解明することで、Aicdaの発現調節機構を調べることを目的としている。
平成27年度は、まず、Bリンパ球のモデル系となるCH12細胞を用い、刺激下で生じる各種の転写調節因子の発現量の変化を調査した。その結果、刺激時に、AIDの発現を制御すると考えられる転写因子の1種であるHoxC4及びBatfの発現量に変化が見られた。そこで次に、CRISPR/Cas9システムを用いて各種転写因子をノックアウト (KO) させた細胞を作成し検討を行ったところ、Batf KO細胞では、刺激によって誘導されるAIDの発現量が著しく低下することが明らかとなった。このことから、Batfが細胞外刺激によって誘導されるAIDの発現に必須の因子であることが考えられた。また、CRISPR/Cas9を用いてAicda発現調節領域上のBatf結合部位を欠損させた細胞を作成した。しかしながら、AIDの発現量の低下は見られず、これまで示されてきた部位とは異なる部位にもBatf結合部位が存在する可能性が示唆された。現在、Aicda発現調節域上の他のBatf結合部位について検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H27年度は、当初の計画の通り、細胞外刺激時にAID発現調節に与える転写因子について、Bリンパ球のモデル細胞を用いて調査を行い、以前の報告と一致して、BatfがAIDの発現に必須の因子であることを明らかにした。同時に、enChIP解析を行うためのCRISPR/dCas9発現プラスミドの作成及びdCas9を恒常的に発現する細胞を作成した。しかしながら、AIDの発現に寄与し得るAicda発現調節領域上のBatf結合部位は、これまで示されてきた部位とは異なる部位に存在する可能性が考えられた。この為、BatfがAicda領域上のどの部位に結合するかを、調べることが必要であると考え、CRISPR/Cas9システムを用いて調査している。CRISPR/dCas9を利用したenChIP法による転写因子―DNA複合体の構造解析は、Batf結合領域を特定した上でH28年度中には完了させる必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、AID発現に寄与し得るAicda領域上のBatf結合領域の特定を行う。その後、得られたBatf結合領域を欠損させた細胞及びBatf KO細胞を用いてenChIP解析を行うことで、Bリンパ球においてAicda領域が形成する構造の解析を行う予定である。
また、28年度は27年度に作成したdCas9発現プラスミドを導入したマウスの作成を行うことで、リンパ球、非リンパ球においてAicda遺伝子領域が形成する構造の違いを調べる為のシステムを確立させる。
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| Causes of Carryover |
研究計画調書に記載し、購入を予定していた分光光度計 (52万円の予算を計上) は、生産終了の為発売を中止していることが分かった。新たに機種選定を行ったが、H27年度中の納入には間に合わなかった。この為、H27年度予算の未使用額が高額になっている。他分野に機器貸出の協力を依頼し、研究遂行に支障はなかったが、引き続き次年度中の購入を検討する。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H27年度未使用分については、H27年度内に購入できなかった分光光度計を購入する為の費用に充てる。H28年度は、上記に示した通り、主に、CRISPR/dCas9を用いたenChIP解析及び、遺伝子導入マウスの作成を行う予定である。このクロマチン免疫沈降法に用いる試薬及び、動物実験・マウス維持費にそれぞれ35万円、15万円の予算を使用する予定である。残りの研究予算40万円の内、5万円を国内学会における研究成果報告の為の旅費に使用し、35万円を細胞培養用器具・試薬及び、プラスミド作成の為の試薬やオリゴ核酸合成として使用する予定でいる。
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