食道扁平上皮癌の増幅遺伝子SOX2のmiRNA発現制御を介した発癌促進機構の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K19040
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 玄 泰行 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80596156)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: SOX2 / PTEN / miRNA

Outline of Annual Research Achievements

SOX2の遺伝子増幅を認める食道扁平上皮癌細胞KYSE140、KYSE70に対してSOX2をノックダウンしたクローンをshRNAを用いて作成した。それらの細胞において、コントロールの細胞と比較し、SOX2の発現低下に伴って発現が低下しているmiRNAを探索する目的でPCR arrayを行った。その結果、miR-17 clusterを含め、複数のmiRNAの発現低下を認めた。miR-17 cluster（miR-17, miR-18, miR-19a, miR-19b-1, miR-20, miR-92）について、定量PCRを行い、arrayの結果を検証した。

PTENをターゲットにしているmiRNAとしてmiR-17 clusterのうち、miR-17, miR-19a, miR-19b-1が報告されていることからこれらのmimicおよびinhibitorを用いてin vitroでPTENの抑制効果を調べた。miR-17については、SOX2を抑制した細胞株に対してmimicを導入してもPTENの抑制は確認できなかった。一方、miR-19a, miR-19b-1はともにこれらの細胞にmimicを導入するとPTENは抑制された。逆にSOX2を抑制していないコントロールの細胞に対してinhibitorを導入すると、miR-19a, miR-19b-1とも程度の差はあるもののPTENの増加を認めた。

以上の結果から、SOX2の遺伝子増幅に伴い、miR-17 clusterは増加し、その結果PTENが抑制されていると考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2つの細胞株において、SOX2の抑制に伴い発現が低下している共通のmiRNAをPCR arrayを用いて拾い上げることがある程度可能であった。安定してSOX2の発現をノックダウンしたクローンを用いることで一過性のノックダウンの実験を省くことができ、miRNA mimicやinhibitorの導入を簡便に行うことが可能であった。

Strategy for Future Research Activity

miR-17 clusterの発現制御をSOX2がダイレクトに行っているかどうかを検証する。まずは、クロマチン免疫沈降を行い、miR-17 clusterのプロモーター領域にSOX2が結合しているかどうかを検証する。また、PCR arrayで発現が低下していた他のmiRNAについても発現の確認（定量PCR）、mimic、inhibitorを用いたin vitroの解析を行う。

Causes of Carryover

余った金額で購入できる必要な試薬がなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

翌年度分として請求した助成金と合わせて使用する。用途としては培養試薬や抗体、miRNA mimicなどの物品費に充てる。