2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K19049
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
星野 瞳 福井大学, 医学部, 特命助教 (90500710)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胆管細胞癌 / EMA / 糖鎖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、癌細胞で特徴的な発現パターンを示す糖鎖の種類と役割解明を目的とし、肝原発性悪性腫瘍の中でも比較的まれで、発症機構が明らかにされていない細胆管細胞癌（CoCC）に焦点を当て、他の肝原発性悪性腫瘍とは異なった発現パターンを示すepithelial membrane antigen（EMA）の糖鎖構造を明らかにし、その病理診断への応用を目指す。
平成27年度は肝原発性悪性腫瘍に分類されるCoCC、肝内胆管癌（ICC）、肝細胞癌（HCC）の各組織型に特徴的な糖鎖の発現パターンを同定したのち、コアタンパク質であるEMAおよび糖鎖の発現を細胞株を用いて再現することにより、糖鎖によるコアタンパク質の機能を明らかにすることを目標とした。まずヒト組織における検討として手術標本の免疫組織染色を実施し、組織型によって糖鎖の発現パターンに違いがあることを確認した。次いで組織切片を用いて蛍光免疫組織染色を行ない、糖鎖の発現とEMAの発現パターンが類似することを明らかにした。糖鎖とEMAを細胞株で強制発現させ、免疫沈降法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ウェスタンブロッティング法を用いて、この糖鎖がEMA上に発現することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに手術標本26症例（CoCC 16症例、 ICC 5症例、HCC 5症例）についての解析を終えた。症例数をさらに増やして解析を行なうため、現在準備を進めている。予備実験の結果、免疫組織染色に用いた抗EMA抗体が免疫沈降法やウェスタンブロッティング法などの分子生物学的実験に適さないことが明らかとなったため、分子生物学的実験で汎用されるFLAGタグをEMAに付加する方法を採用し、EMA遺伝子をサブクローニングする際にFLAG配列を融合した。この遺伝子産物をin vitro実験に使用することで、抗FLAG抗体を用いた免疫沈降が容易となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度は糖鎖修飾されたEMAの機能解明を目指す。CoCCは比較的まれであるため、初代培養株を樹立することが困難であり、CoCC由来の細胞株は未だ樹立されていない。そこで現在入手可能なヒト胆管上皮細胞株のなかからEMA陽性の細胞株を選別し、糖鎖陽性群と陰性群に分けたうえで、次の実験を行なう。1）上面がマトリゲルで覆われたTrans-wellを用いて、細胞浸潤能、移動能を評価する。2）MTTアッセイキットを用いて、細胞の増殖能を評価する。
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