2016 Fiscal Year Research-status Report

内分泌顆粒形成にPROX1遺伝子が果たす役割の解明

Research Project

Project/Area Number	15K19056
Research Institution	Kyorin University
Principal Investigator	石井順杏林大学, 医学部, 助教 (80749599)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	PROX1 / 甲状腺癌 / 甲状腺ホルモン / 細胞増殖
Outline of Annual Research Achievements	平成28年度はPROX1遺伝子が内分泌顆粒形成以外の細胞機能に与える影響、特にホルモン産生と腫瘍細胞の増殖活性に与える影響について解析を行った。PROX1が内分泌細胞のホルモン産生・分泌の制御に関与しているならば、内分泌細胞の機能を制御する因子として非常に大きな役割を担っていることになる。そこで甲状腺髄様癌が高度に産生し、腫瘍マーカーとしても用いられているカルシトニンにPROX1が与える影響を解析した。まず甲状腺髄様癌細胞TTがカルシトニン遺伝子(CALCA)を高度に発現することを確認した後、PROX1発現をshRNA法により抑制したが、CALCA発現に著変はみられなかった。また通常はカルシトニン産生のほとんどみられない甲状腺乳頭癌由来の細胞株KTC1にPROX1遺伝子を導入したが、CALCA発現は著明に亢進しなかった。このことから、PROX1は内分泌顆粒関連遺伝子の発現誘導には機能するが、内分泌顆粒内に包埋されるホルモン自体の発現には大きく影響しないと推測された。 PROX1は腎臓がん細胞や肝臓がん細胞において転移や増殖能に影響を与えることが報告されている。内分泌腫瘍細胞で高度に発現するPROX1が同様の影響を示す場合、新たな治療標的となることが期待される。そこで甲状腺乳頭癌細胞にPROX1を強制発現させた際の増殖活性の変化を増殖アッセイで解析したが、著変はみられなかった。反対にPROX1を抑制した甲状腺髄様癌細胞においては、抑制初期には増殖速度の低下が認められたが、やがてコントロール株との間で増殖速度に差がみられなくなった。このことから、甲状腺癌細胞においてはPROX1発現が腫瘍の増殖に大きく影響していないことが示唆された。以上の結果から、内分泌細胞におけるPROX1の機能は、特に内分泌顆粒形成に特化したものであると推測された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 平成28年度はPROX1遺伝子が内分泌系細胞のホルモン産生と増殖活性に与える影響の解析を計画していた。In vitroでの培養細胞を用いた検討から、PROX1がホルモン産生や増殖活性に与える影響は大きくない可能性が示された。一方で計画では、PROX1と細胞増殖との関連性が低かった場合、浸潤能や転移能といった別の側面への影響を解析する予定であったが、一部の培養細胞の増殖速度の遅さが律速段階となり着手することが出来なかった。
Strategy for Future Research Activity	平成28年度に着手することが出来なかった、PROX1が腫瘍細胞の浸潤・転移能に与える影響を解析する。まず培養細胞を用いた解析を行い、PROX1発現と浸潤・転移能に相関がみられた場合、マウスを用いた移植腫瘍実験に移行する。また、これまではPROX1の安定発現株をポリクローナルな集団として実験に供していたが、モノクローン化することでPROX1が細胞に与える影響をより明瞭に検討出来る可能性、および実験に供し易い株が得られる可能性が考えられるため、検討する。
Causes of Carryover	研究実施計画に従い、次年度はPROX1が腫瘍細胞の浸潤・転移能に与える影響を中心に解析を進める。細胞の浸潤能の解析には、一般にボイデンチャンバーを用いた検討が行われ、研究代表者も同様の検討を行う予定である。また細胞の転移能の解析には実験動物（マウス）を用いる予定である。さらにこうした培養細胞の転移・浸潤能の変化を裏付けるため、ZEB1やSNAI1といった転移に関連する遺伝子の発現状態を確認する必要がある。研究の遂行に必要となるボイデンチャンバーや実験動物、遺伝子発現解析試薬（逆転写酵素、DNAポリメラーゼなど）は新規に購入しなければならないため、次年度使用額が必要となる。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度使用額は以下の通りに使用する計画である。 1. 培養細胞の維持および移動・浸潤能の解析用消耗品の購入。2. 実験動物（マウス）および移植腫瘍実験に使用する消耗品の購入（シリンジ、注射針など）。3. 培養細胞および移植腫瘍細胞（ゼノグラフト）における遺伝子発現解析用試薬の購入。