2015 Fiscal Year Research-status Report
新規ミューテーターマラリア原虫の開発と突然変異体創出システムの構築
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15K19089
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
本間 一 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (10617468)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | マラリア / Plasmodium / ミューテーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
熱帯熱マラリア原虫では、過去あらゆる抗マラリア薬に対して耐性株が出現してきた。最近では、現在最も有効とされるアルテミシニンに対してさえも耐性株が報告されてきている。マラリアの制御を達成していくためには、薬剤耐性など重要な形質に関するより詳細な生物学的理解が必須であり、これまでにない革新的な研究アプローチが求められる。本研究では、熱帯熱マラリア原虫が持つDNA修復遺伝子MLH1の機能を欠損させることで新規のミューテーター原虫（MLH1ミューテーター原虫）を開発し、その変異発生傾向を詳細に解明する。さらに、MLH1ミューテーター原虫を用いた効率的な突然変異体創出のための実験系の構築を目指す。
本年度は、MLH1ミューテーター原虫をCRISPR/Casシステムにより作製するためのベクターの開発に取り組んだ。熱帯熱マラリア原虫のMLH1（PfMLH1）とヒトや酵母のMLH1のアミノ酸配列を比較し、保存性の高いアミノ酸サイトを特定した。その中から、1) Cas9エンドヌクレアーゼによる切断サイトに近接していること、2) 変異を導入することで予想されるミューテーター形質の強さを考慮し、PfMLH1遺伝子上の変異を導入する候補サイトと導入変異の種類を決定した。CRISPR/Casシステムに用いるベクターにCas9エンドヌクレアーゼを誘導するガイドRNA配列と部位特異的変異導入法で作製した変異型PfMLH1遺伝子配列を組み込むことで、ベクターを構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CRISPR/Casシステムによる熱帯熱マラリア原虫のゲノム編集に必要なベクターを複数個構築することに成功した。構築したベクターを用いて、電気穿孔法による原虫のトランスフェクションも既に試みている。今後、薬剤選択により組換え原虫をセレクションし、増殖が確認された場合は限外希釈によるクローニングでMLH1ミューテーター原虫を確立する。
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| Strategy for Future Research Activity |
作製したMLH1ミューテーター原虫について、1) 長期のin vitro継代培養によるゲノムDNAへの変異の蓄積、2) 次世代シーケンサーを用いた蓄積変異のゲノムワイド変異解析を行う。これらの結果から、野生型原虫と比べてMLH1ミューテーター原虫の突然変異率がどの程度上昇したのか、また、どのような変異蓄積傾向を示すのかを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
備品や消耗品の価格変動などにより次年度使用額が多少生じたが、概ね計画通り使用できている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
主に試薬などの消耗品の購入に使用する予定である。研究成果がある程度まとまり次第、学会などで積極的に発表していく。
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