2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K19118
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
塩田 智之 国立感染症研究所, ウイルス第二部, リサーチレジデント (80616144)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | E型肝炎ウイルス（HEV） / レセプター（ウイルス受容体） / ウイルス様中空粒子（VLP） / HEV非感受性細胞 / 感染阻害 / CRIPR/Cas9 / ゲノム編集 / 感受性復帰 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
E型肝炎ウイルス（HEV）について、感受・非感受性細胞の解析から有望なレセプター（ウイルス受容体）候補を得、結合、結合阻害、ノックアウトによる感受性抑制、非感受性細胞への感受性付与に成功している。今年度は、下記を実施した。
1）レセプター候補と大・小ウイルス様中空粒子（VLP）の結合特性解析。感染性ウイルスとの結合確認の前段階として、小さいサイズのVLPとの結合能について検討した。小さいサイズのVLPは遺伝子を内包せず、大きいサイズのVLPは感染性ウイルスにより構造が近い為、両者とレセプター候補の間には結合特性に差異があることが予想され、今回認められ、現在詳細な実験を行っている。
2）抗レセプター候補抗体によるHEV感染阻害効果確認を目指した抗体作製。HEV感染実験には長期間を要し、大量の抗体が必要な為、レセプター候補組換え抗原を用いたウサギ抗体の作製を行ったが、感染阻害は認められなかった。ヒトとウサギとの当該因子の相同性は高く、生理学的に重要なエピトープの相同性も高いことが予想され、感染を効果的に阻害する抗体の作製は困難であると考えられた。そこで、相同性が低いニワトリを用いて抗体作製を行った。
3）CRISPR/Cas9による感受性細胞ゲノム編集による候補因子削除後の検証。複数のノックアウト細胞クローンにおいて、候補因子全長および空のベクターを導入した所、感受性復帰よりもむしろ更に抑制される現象が確認されている。詳細な機構は不明であるが、ノックアウトによって不完全な候補因子発現形態が残存した場合、ノックインにおける発現が阻害されると同時に、より高次の機能的発現抑制を引き起こしていることが考えられる。残りのクローンにおいても実験を行い、感受性を確認している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1）レセプター候補のHEV直接結レセプター候補と大・小ウイルス様中空粒子（VLP）の結合特性解析。レセプター候補と両者の間には結合特性に差異があることが予想されていたが、予想通り差が認められ、現在詳細な実験を行っており、おおむね順調に進展している。
2）抗レセプター候補抗体によるHEV感染阻害効果確認を目指した抗体作製。VLPとFc融合レセプター候補間の結合阻害を基に、ウサギポリクローナル抗体を作製したが種間相同性の高さから感染阻害が確認されず、より遠縁にあたるニワトリを用いたポリクローナル抗体の作製が完了しており、おおむね順調に進展している。
3）CRISPR/Cas9による感受性細胞ゲノム編集による候補因子削除後の検証。候補因子のノックアウト細胞によるノックインは感受性復帰よりもむしろより感受性を抑制することが確認されている。詳細な機構は不明であるが、ノックアウトのされ方に起因する可能性を鑑み、他のノックアウト細胞クローンにおいても同様の実験を行って感受性の確認を行っており、おおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）レセプター候補のHEV直接結合能の検証。レセプター候補と大・小VLPとの結合特性解析を引き続き行う。更に、VLPに比べて収率が低いことが課題ではあるが、感染性を持つHEVとの直接結合の確認を行う。
2）抗レセプター候補ニワトリポリクローナル抗体の感染阻害能の検証。ウサギポリクローナル抗体によっては確認することが出来なかった感染阻害を、新たに作製したニワトリポリクローナル抗体の使用によって確認する。
3）CRISPR/Cas9による感受性細胞ゲノム編集による候補因子削除後の検証。現在までの所、候補因子ノックアウト細胞に対する候補因子搭載ベクター導入による感受性復帰は確認できていない。保有するノックアウト細胞クローン全てに対して同様の実験を行い、感受性復帰の可能性を検討する。
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| Causes of Carryover |
年度末納品等にかかる支払いが平成29年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成28年度分についてはほぼ使用済みである
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記のとおり。
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[Presentation] Characterization of a hepatitis E virus receptor candidate2016
Author(s)
3.Tomoyuki Shiota, Tian-Cheng Li, Sayaka Yoshizaki, Yorihiro Nishimura, Hiroyuki Shimizu, Masayuki Shimojima, Masayuki Saijo, Takaji Wakita, Koji Ishii.
Organizer
HCV2016 - 23rd International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
Place of Presentation
Kyoto International Conference Center
Year and Date
2016-10-11 – 2016-10-11
Int'l Joint Research
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