2015 Fiscal Year Research-status Report
Notchシグナルによる小腸上皮間リンパ球の制御を介した腸管恒常性維持機構の解明
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15K19131
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
石舟 智恵子 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 助教 (80632645)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 腸管上皮間リンパ球 / Notchシグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまでTCR alpha beta陽性CD8 alpha alpha陽性の腸管上皮間リンパ球(CD8aaIEL)の数がCD4特異的なNotchシグナル伝達に必須の転写因子Rbpjの欠損(Rbpj4-KO)により減少することを見出している。予備データを元に本年度はCD8aaIELの制御に関与しているNotchシグナルの構成因子と標的遺伝子の解析を中心に研究を進めた。
CD8aaIELはNotch1とNotch2を発現し、Notch3, 4はほとんど発現しなかったため、CD4-Cre Notch1, Notch2の欠損マウスを用いて解析を行い、CD8aaIELの分化と成熟はNotch1とNotch2の単独および両方の欠損で障害されることを明らかにした。CD8aaIELは胸腺前駆細胞から分化し、粘膜固有層を介して上皮内に局在すると考えられている、CD8aaIELの胸腺前駆細胞の数や表現系はRbpj4-KOマウスで変化がなく、粘膜固有層ではCD8aaの表現系をもつ細胞自体ほとんど存在しなかったため、CD8aaIELは粘膜固有層から上皮細胞間へ局在が変化する際にNotchシグナルの刺激を受けると考えられた。他方で、予備データでRbpj-4KOマウスに恒常活性型STAT5を過剰発現するとCD8aaIELの数の減少が回復したことから、NotchとSTAT5の関連性について解析し、Rbpj-4KOマウスのCD8aaIELではSTAT5を介するサイトカインセセプターの発現には影響はないものの、STAT5bの発現が低下していることを見出した。しかし、T細胞セルラインにNotch1レセプターの細胞内ドメイン(N1IC)を過剰発現させても、STAT5b mRNAの発現レベルは変化しないことからNotchはSTAT5bの発現を直接制御しないことが考えられた。マイクロアレイ解析によりRbpj4-KOマウスのCD8aaIELで発現が低下し、STAT5bに代わる新たなNotchシグナルの標的遺伝子の候補がいくつか明らかになり、これらの遺伝子の発現ベクターの作製を終了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Notchシグナルはリガンドとレセプターの組み合わせによってシグナルが伝達されるため、CD8aaIELの分化・成熟に関与するNotchのレセプターとリガンドを明らかにすることが重要である。本年度はCD8aaIELの分化・成熟に関与するNotchレセプターがNotch1とNotch2であることを明らかにした。また、胸腺・粘膜固有層の解析を通じて、Notchシグナルの刺激を受ける時期が上皮細胞間に局在する時期であることを想定できたため、今後リガンドの供給源が上皮細胞や樹状細胞であることを検討するために、マウスの交配と解析を進めることが可能になった。他方で、CD8aaIELではSTAT5のうちSTAT5aではなくSTAT5bの発現低下が認められ、この変化がCD8aaIELの減少に影響していることが考えられた。また、NotchによるSTAT5の発現制御は直接的ではなく、Notchは別の因子を介して間接的に制御していると考えられた。さらに、マイクロアレイ解析によりNotchシグナルの標的遺伝子の候補がいくつか明らかになった。この候補遺伝子は過去の抹消リンパ組織に存在するT細胞を用いたマイクロアレイ解析からもRbpj欠損で発現低下が起こることやデータベースでCD8aaIELに高発現する遺伝子であることが示唆されている。以上から、本年度は予定した解析のほとんどを終了したとともに、Notchの構成因子と新たなNotch標的遺伝子の候補が明らかになり順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)リガンドの供給細胞の解析：リガンドの供給源が上皮細胞であるかをVillin1-Creマウス、また樹状細胞であるかをCD11c-Creマウスと5種のリガンドのうち3種Dll1, Dll4, Jag1の条件的遺伝子欠損マウスを交配して解析する。現在、約半分の組み合わせの解析を終了したが、今のところ、どの細胞がリガンドの供給源であるかは明らかではないため、今後は交配を進めて解析を行い、リガンドの供給源を明らかにする。
(2) Notchの標的遺伝子の解析：マイクロアレイ解析によって明らかになったNotchシグナルの標的候補遺伝子の発現ベクターを用いてRbpj-4KOの骨髄細胞に遺伝子を過剰発現し、この細胞を放射線照射したマウスに移入する骨髄キメラを作製する。骨髄キメラマウスにおいてCD8aaIELの減少や成熟の障害が回復するかどうかを解析する。
(3)CD8aaIELの機能の解析：本年度にRbpj4-KO でCD8aaIELが減少することによる生理的な影響をTNBS腸炎とDSS腸炎モデルをRbpj-4KOマウスに適応して病態の変化を検討したが病態の変化が認められなかった。そこで、より慢性の腸炎モデルとして低濃度のDSSを長期投与する系を用いて病態の変化を解析する。個体の生存や体重減少に変化が認められた場合には、組織染色・サイトカイン産生などで炎症をさらに評価し、CD8aaIELの機能を検討する。
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| Causes of Carryover |
平成２８年３月納品となり、支払いが完了していないため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成２８年４月に支払い完了予定である。
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