2015 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
15K19160
|
|---|
| Research Institution | University of Tsukuba |
|---|
Principal Investigator |
山本 祥之 筑波大学, 附属病院, 病院講師 (00649288)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | MDM4 / siRNA / dsRDC / p53 / ETS / KRAS変異 / BRAF変異 / MDM2 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
癌抑制遺伝子であるTP53の機能は悪性腫瘍の約半数において変異型失活をきたしているが、野生型TP53腫瘍においてもTP53の機能を抑制する癌遺伝子であるMDM2やMDM4によりp53の活性は低下している。そこで我々はMDM2やMDM4を標的としたDNA修飾siRNA (dsRDC) の開発研究を行ってきた。さらに、MDM4はMAPKシグナル伝達経路の下流にあるETSの転写活性化を介して発現が亢進すると推定されており、本研究では、MDM4 dsRDCとMAPKシグナル伝達阻害薬との併用効果を検証し、新たな治療戦略を確立することを目的としている。
MDM4高発現野生型TP53細胞株のうち、胃癌細胞株SNU-1 (KRASコドン12変異)、大腸癌細胞株HCT116 (KRASコドン13変異)、大腸癌細胞株LoVo (KRASコドン13変異)、悪性黒色腫A375 (BRAF V600E変異) の４種類に対して、in vitroにおけるMDM4 dsRDCとMEK阻害薬であるTrametinibの併用効果をWST-8 assayで検討した。各細胞株に対するMDM4 dsRDCの投与濃度はWestern blot法を用いて十分なknock-down効果が得られる至適濃度とし、Trametinibの投与濃度は細胞株毎に算出したIC50より決定した。併用投与による薬剤相互作用の有無はCombination Index (CI) を算出することで評価した。結果はSNU-1細胞株で最も強い相乗効果が確認でき、他の3種類の細胞株でも同様の傾向が示された。
また、今後のin vivoでの抗腫瘍効果の検討を見据えて、MDM4 dsRDCのデリバリーツールとしてsuper Carbonate apatite (sCa) を用いたDrug Delivery System (DDS) の開発研究も平行して行った。このsiRNA結合sCaの細胞導入効率をLuciferase Assayを用いて検討した。In vitroにおいて、FL-HCT116 (Firefly Luciferase導入HCT116細胞株) に対して、Lipofectamine RNAiMAXおよびsCaを用いてsiFLucを導入させ、その導入効率の比較を行ったところ、両者はほぼ同等の導入効率であることが確認できた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
in vivoの際に利用するデリバリーツールとして検討している sCa に関して、大阪大学よりその技術提供を受けたが、再現性の確認や、さらに導入効率を上昇させるための添加物等の条件検討に時間を要した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究でKRASやBRAF変異を有するMDM4高発現野生型TP53細胞株に対するMDM4 dsRDCとMEK阻害薬の併用による相乗効果が確認できた。今後は、この相乗効果のメカニズムの解明のための実験を推進していく。具体的には、各細胞株でMDM4の発現亢進にMAPKシグナル伝達経路下流のETSがどの程度関わっているのか、加えてMAPKシグナル伝達経路のKRASやBRAFなどの各遺伝因子変異がどの程度影響を及ぼしているのかを検証し、これらのタンパク発現が各薬剤単独および併用投与によってどの程度変化するかを確認する。加えてp53、p21、アポトーシス関連タンパク (PUMA、Noxaなど) の発現変化を Western blot法やRT-qPCR法で確認する。また、MEK阻害薬の他にも、RAF阻害薬等の他のMAPKシグナル伝達阻害薬との併用でも同様の相乗効果が得られるかを検討していく。さらに、相乗効果が確認できた併用薬ではin vivo実験でもその抗腫瘍効果を検証していく。
|
| Causes of Carryover |
in vitroでの実験が予定よりやや遅れ、予定されていた実験が次年度へ移行の方針となり、それに必要な試薬、消耗品の購入も次年度へ延期となったため。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度で予定するin vitroで使用する試薬、消耗品の購入に当てる。
|
