肝炎ウイルス感染時の宿主自然免疫応答機構とウイルスによるその阻害機構の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K19316
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 新田 沙由梨 東京医科歯科大学, 医学部, プロジェクト助教 (20527056)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: C型肝炎 / B型肝炎 / 自然免疫応答

Outline of Annual Research Achievements

研究代表者は、①以前に明らかにしたC型肝炎ウイルス（HCV）による宿主自然免疫応答の阻害機構に関する知見を発展させ、詳細な解析を進めることで、この機構がIFN治療効果に与える影響を解析する事、②①の戦略を応用し、B型肝炎ウイルス（HBV）による自然免疫阻害機構を解析する事、により、肝炎ウイルスの持続感染のメカニズムの一端を明らかにすることを目的として研究を行い、以下の実績を得た。
1. IFNβ, IL28B誘導抑制に関わるNS4Bの機能ドメイン解析：promoter assayにより、HCV-NS4BのN末端側がIFNβだけでなくIL28Bのpromoter活性の抑制にも重要である事を見出した。一方、IL28B promoterに関してはSNPの違いによる差は明らかでなかった。アラニンスキャンによる検討から、NS4B蛋白の24-27番目アミノ酸を含む領域がこの機能に関わる重要なドメインである事を示した。
2. HBV感染時のpattern recognition receptors (PRRs)を介した自然免疫応答機構の解明： genotype DのHBV恒常発現株 (Hep2.2.15.7細胞；M. Iwamoto et al. BBRC 2014)の培養上清を細胞に感染後、細胞内cccDNA、上清中ウイルスDNAの測定等によって感染効率の評価を行い、効率的な感染条件を検討中である。また、1.24倍長HBVプラスミドを用いることにより、別のgenotypeでも同様の検討も進めている。
3. HBVによる自然免疫阻害機構の解析：HBVの1.24倍長プラスミドを導入した細胞において、IFNα処理時のISGや自然免疫関連分子の発現とその変化を定量PCRやウェスタンブロットにより評価した。その結果、HBVプラスミド導入時と非導入時で複数の分子の発現に差を認める事が明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1. IFN-βおよびIL28B(IFN-λ3)誘導抑制に関わるNS4Bの機能ドメイン解析、に関しては当初の計画通り研究を進めることができ、一定の成果を得ることができた。すなわちHCV-NS4B蛋白のIFN-β、IFN-λ3の誘導抑制機能を担うドメインの一部として、N末端側の4アミノ酸という狭い領域を同定する事ができた。今後、HCV感染患者血清等の臨床検体を用いて、ウイルスのアミノ酸変異とIFN治療効果との関連を検討することにより、本研究で同定したNS4Bの機能ドメインの臨床病態学的な意義を明らかにすることができ得るものであり、重要な知見と考えられる。

2. HBV感染時のpattern recognition receptors (PRRs)を介した自然免疫応答機構の解明、に関しては解析を進める上で鍵となるHBVの効率よい感染に必要な条件を検討中であり、準備が整い次第PRRの発現によるHBV複製増殖への影響に関する解析を進めることができる状態である。並行して、当初平成28年度に計画していた。HBVによる自然免疫阻害機構の解析、を一部平成27年度に計画を早めて行った。これらの解析により、IFN処理による複数の自然免疫関連分子の発現変動が、HBV導入時と非導入時で異なる事が示され、HBV感染時の臨床学的病態やIFN治療時の臨床経過に関連する可能性が考えられた。詳細な解析を進めることで、HBVの持続感染や治療効果を規定する因子に関わる要因とそのメカニズムの一端を明らかにしうると考えられる。

以上のように、研究計画はおおむね順調に進展しているものと思われる。

Strategy for Future Research Activity

1. HCVが自然免疫機構に与える影響についての解析：これまでの検討から、HCV-NS4BのN末端側にIFN誘導抑制作用を担うドメインの一部を同定した。そこで当初の計画通り、HCV感染患者血清等の臨床検体を用いて、ウイルスのシークエンス解析を行うことにより、NS4Bの変異がIFN治療効果に及ぼす影響について臨床病態学的解析を行っていく。これにより、本研究で明らかにしたNS4BによるIFN抑制作用の臨床病態学的意義の解明を試みる。
2. HBVと自然免疫機構の関連、HBVが自然免疫機構に与える影響についての解析：これまでの検討から、HBVの存在によりIFNα処理時の自然免疫関連分子の発現が変化する事が示唆された。そこで当初の計画通り、前年度行った研究を発展的に実施、継続していく。すなわち、HBVプラスミドの強制発現によって得られた結果について、HBVの感染系での検証を進める。また、網羅的な解析としてmicro array等の手法も用いて、HBV感染時、特にIFN処理時の遺伝子発現の変動に大きな差を認めるような分子を探索する。これらの解析により、期待するような分子が探索された場合には、探索された分子とウイルス分子との分子間相互作用の解析やそれぞれの分子の局在の検討など詳細な解析を行う。
更に、HBV感染後の臨床経過にはgenotypeによる違いが報告されており、そのメカニズムの解明は治療法を検討していく上で重要な知見となり得る。そこで、当初の計画に加えて、前述したような解析を、異なるgenotypeのHBVプラスミド(genotype A, B, C)を用いて行い、その差異が生じるメカニズムの解析を試みる。
これらの検討から、自然免疫応答阻害に関わるウイルス蛋白とこれが標的とする自然免疫系分子が同定できれば、同定した分子の肝生検組織における局在や血清中の動態に関する解析も検討する。

Causes of Carryover

試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

検討する数・種類を拡大して解析を行うため、試薬を増量して購入する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Evaluation of Interferon Resistance in Newly Established Genotype 1b Hepatitis C Virus Cell Culture System. (2016)
  • Author(s): Taniguchi M, Tasaka-Fujita M, Nakagawa M, Watanabe T, Kawai-Kitahata F, Otani S, Goto F, Nagata H, Kaneko S, Nitta S, Murakawa M, Nishimura-Sakurai Y, Azuma S, Itsui Y, Mori K, Yagi S, Kakinuma S, Asahina Y, Watanabe M.
  • Journal Title: J Clin Transl Hepatol. Volume: 4 Pages: 5-11
  • DOI: 10.14218/JCTH.2015.00047.
  • Open Access
• [Journal Article] Matrix metalloproteinase-14 mediates formation of bile ducts and hepatic maturation of fetal hepatic progenitor cells. (2016)
  • Author(s): Otani S, Kakinuma S, Kamiya A, Goto F, Kaneko S, Miyoshi M, Tsunoda T, Asano Y, Kawai-Kitahata F, Nitta S, Nakata T, Okamoto R, Itsui Y, Nakagawa M, Azuma S, Asahina Y, Yamaguchi T, Koshikawa N, Seiki M, Nakauchi H, Watanabe M.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 469 Pages: 1062-8
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Comprehensive analyses of mutations and hepatitis B virus integration in hepatocellular carcinoma with clinicopathological features. (2016)
  • Author(s): Kawai-Kitahata F, Asahina Y, Tanaka S, Kakinuma S, Murakawa M, Nitta S, Watanabe T, Otani S, Taniguchi M, Goto F, Nagata H, Kaneko S, Tasaka-Fujita M, Nishimura-Sakurai Y, Azuma S, Itsui Y, Nakagawa M, Tanabe M, Takano S, Fukasawa M, Sakamoto M, Maekawa S, Enomoto N, Watanabe M.
  • Journal Title: J Gastroenterol. Volume: 51 Pages: -
  • DOI: 10.1007/s00535-015-1126-4.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Impaired induction of interleukin 28B and expression of interferon λ 4 associated with nonresponse to interferon-based therapy in chronic hepatitis C. (2015)
  • Author(s): Murakawa M, Asahina Y, Nakagawa M, Sakamoto N, Nitta S, Kusano-Kitazume A, Watanabe T, Kawai-Kitahata F, Otani S, Taniguchi M, Goto F, Nishimura-Sakurai Y, Itsui Y, Azuma S, Kakinuma S, Watanabe M.
  • Journal Title: J Gastroenterol Hepatol. Volume: 30 Pages: 1075-84
  • DOI: 10.1111/jgh.12902.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] HCV NS5A阻害剤耐性変異株の特徴と薬剤感受性に関する検討 (2016)
  • Author(s): 新田沙由梨、朝比奈靖浩、加藤孝宣
  • Organizer: 第102回日本消化器病学会総会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 2016-04-21 – 2016-04-21
• [Presentation] In Vitro Characterization and Drug Sensitivity Analysis for HCV NS5A Resistance-Associated Variants (2016)
  • Author(s): Sayuri Nitta, Yasuhiro Asahina, Takaji Wakita, Takanobu Kato
  • Organizer: APASL2016
  • Place of Presentation: グランドプリンスホテル新高輪（東京都港区）
  • Year and Date: 2016-02-21 – 2016-02-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Effects of Resistance Mutations of NS5A Inhibitor on Viral Production and Susceptibility to Anti-HCV Reagents in Recombinant Hepatitis C Viruses with NS5A of Genotype 1b (2015)
  • Author(s): Sayuri Nitta, Yasuhiro Asahina, Takaji Wakita, Takanobu Kato
  • Organizer: AASLD the Liver Meeting 2015
  • Place of Presentation: San Fransisco（USA）
  • Year and Date: 2015-11-15 – 2015-11-15
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] HCV感染培養系を用いたDaclatasvir耐性変異株の抗HCV薬に対する薬剤感受性の評価 (2015)
  • Author(s): 新田沙由梨、村山麻子、藤田めぐみ、山田典栄、政木隆博、脇田隆字、朝比奈靖浩、加藤孝宣
  • Organizer: 第51回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: ホテル日航熊本（熊本県熊本市）
  • Year and Date: 2015-05-21 – 2015-05-21
• [Book] 新ウイルス性肝炎学 (2015)
  • Author(s): 新田沙由梨、坂本直哉、朝比奈靖浩
  • Total Pages: 704
  • Publisher: 日本臨床