BTB蛋白を介したCullin3 E3リガーゼの新たな消化器疾患メカニズムの解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K19343
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 尾関 啓司 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70750610)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 胃癌 / 大腸癌 / ユビキチン化 / BTB-ZnFドメイン蛋白 / Ｃｕｌｌｉｎ３

Outline of Annual Research Achievements

今回、我々は消化管細胞における BTB-ZnF ドメイン蛋白質-Cullin3-E3 ユビ キチンリガーゼ複合体が果たしている役割について検討することであらたな癌治療や抗炎症治療ターゲットを見出し 治療に役立てることを本研究の目的としている。
BTB-domain proteinとCullin3の蛋白精製とSiRNAの作成。コムギ胚芽無細胞蛋白質合成法を利用し、ZnF-BTB蛋白質遺伝子129種のタンパク質とCullin3蛋白を作成したものを共同研究の愛媛大学から提供頂いた。また、同様に共同研究所の愛媛大学から提供していただいた、129種類のZnF-BTB蛋白質に対するsmall interfering RNA（SiRNA）を提供していただいた。
次に胃癌細胞株と大腸癌細胞株においてCullin3の存在をWestern blotting（WB）法を使用して蛋白レベルで、また、定量的Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)を使用してmRNAレベルで確認した。Cullin3はmRNAレベルでも蛋白レベルでも認められた。 Cullin3のSiRNAは蛋白レベルとmRNAレベルでCullin3が有効であることが確認された。Cullin3のみのSiRNAでは形質発現を現在検討中である。
最後に、試験管内で合成したZnF-BTB蛋白質とCullin3蛋白を使用することで、Alpha screening assayにおいて、Cullin3と結合するZnF-BTB蛋白の同定を試みた。試験管内でCullin3と結合する可能性のあるBTB蛋白118種類を同定した。現在そのなかから癌細胞株で細胞増殖・遊走能・浸潤能に関連している蛋白の同定を試みている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

Alpha screening assayにおいて、Cullin3と結合するZnF-BTB蛋白の同定を試みた。試験管内でCullin3と結合する可能性のあるBTB蛋白118種類を同定した。現在そのなかから癌細胞株で細胞増殖・遊走能・浸潤能に関連している蛋白の同定を試みている。
同定されたBTB蛋白が大量でそれぞれの機能解析を行うのが困難を極めている。

Strategy for Future Research Activity

今後、同定されたBTB蛋白の消化器系癌細胞におけるin vivo・in vitroの役割ついてさらに検討していく予定である。また、ヒトの癌患者検体を使用して、癌と同BTB蛋白の関連について検討していく予定である。

Causes of Carryover

実験の進行が遅れており必要な機材や薬剤の購入を差し控えたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

今後実験の進行に伴い必要な機材や薬剤、動物を購入していく予定。