2015 Fiscal Year Research-status Report

過酸化水素シグナルに着目した、脂肪性肝疾患の新規病態機序・治療法の解明

Research Project

Project/Area Number	15K19348
Research Institution	Keio University
Principal Investigator	寺谷俊昭慶應義塾大学, 医学部, 特任助教 (40624408)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	脂肪肝 / CuZn-SOD
Outline of Annual Research Achievements	我々は、脂肪肝マウスモデルでCuZn-SODを欠失させると、脂肪肝が劇的に改善するという結果を得た。CuZn-SODを介し産生される肝細胞細胞質過酸化水素が、レドックス依存的に肝臓PPARγシグナルを活性化するという脂肪肝形成促進機序が想定された。肝細胞特異的にCuZn-SODなどを欠損させた遺伝子変異マウスを用いて研究を進展させ、細胞質の過酸化水素とCuZn-SODとに着目し脂肪肝病態の分子機序の解明と、新規治療法確立を目的とした。我々はCre-LoxPシステムを用いて肝細胞特異的CuZn-SOD欠損マウスを作成した。このマウスとob/obマウスとの交配により、2重変異体を作成した。野生型、肝細胞特異的CuZn-SOD欠損マウス、ob/obマウスおよび2重変異体マウスの4群に分け、生後5週目から体重と摂餌量を調べ、生後15週までの解析を行った。摂餌量は、野生型に比べob/obマウスで有意に高値を示した。一方で、野生型マウスと肝細胞特異的CuZn-SOD欠損マウスの摂餌量は同等であった、また、ob/obマウスおよび肝細胞特異的CuZn-SOD欠損・ob/ob二重変異マウスの摂餌量は同じであった。生後15週までの体重増加は、野生型に比べob/obマウス群で顕著であった。しかし、生後15週までの体重増加に肝細胞特異的CuZn-SOD欠損は影響を及ぼさなかった。生後15週における耐糖能について、糖負荷試験およびインスリン感受性試験を施行し評価した。野生型および肝細胞特異的CuZn-SOD欠損マウスの耐糖能はほぼ同じであった。一方で、ob/obマウスは、インスリン抵抗性を呈したが、ob/obマウスおよび肝細胞特異的CuZn-SOD欠損・ob/ob二重変異マウスの耐糖能はほぼ同じであった。肝細胞特異的CuZn-SOD欠損は、全身のインスリン抵抗性に影響を与えないことが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初の計画において、我々は野生型、肝細胞特異的CuZn-SOD欠損マウス、ob/obマウス、各々の2重変異体マウスの4群に分け、生後5週目から体重と摂餌量を調べ、生後24週におけるマウスの肝臓、内臓脂肪、皮下脂肪、骨格筋、血清を採取し種々の解析（脂肪肝・肝障害・肝臓線維化の差異を組織学的、血清学的の評価検討、肝臓・脂肪組織および骨格筋中トリグリセリド定量、肝臓・脂肪組織および骨格筋より細胞質とミトコンドリア単離しこれらオルガネラに含まれる過酸化水素・蛋白質の過酸化・脂質過酸化の定量）を施行する予定であった。これらと同様の検討を、肝細胞特異的CuZn-SOD欠損マウスとdb/dbマウスとの2重変異体も作成し施行する予定であった。しかし、ob/obマウスおよびdb/dbマウスが不妊であることから自然交配による2重変異体マウスの作成が難しく、in vivo解析に使えるだけの十分なマウス数を確保することが困難であった。そのため、実験開始がやや遅れてしまった。現在、この問題を解決するべく、遺伝子組換えマウスを体外受精と胚移植によって一度に大量に繁殖する技術を稼働させている研究協力者に、本研究で進める大規模な遺伝子組換えマウスの作成を依頼している。
Strategy for Future Research Activity	野生型、肝細胞特異的CuZn-SOD欠損マウス、ob/obマウス、各々の2重変異体マウスの4群に分け、生後24週で解剖する。その各群のマウスの肝臓、内臓脂肪、皮下脂肪、骨格筋、血清を採取し、脂肪肝・肝障害・肝臓線維化の差異を組織学的 (HE染色、Oil Red O染色、マッソントリクロム染色）、血清学的に評価検討する。また肝臓中トリグリセリド定量、肝臓中（細胞質、ミトコンドリア、全組織の各々で）過酸化水素定量・カルボニルアッセイ・脂質過酸化定量を施行する。各群の肝臓よりRNA、蛋白質を抽出し、DNA array法、Real time PCR法、Western blot法、免役沈降と非還元状態・還元状態でのSDS-PAGE、ゲルシフトアッセイ、核蛋白質Western blot法を用い、PPARγシグナル活性化定量解析を施行するとともに、PPARγ2、PPARγ2下流のFsp27などの分子の発現変動、CuZn-SOD、Mn-SOD、Catalase、Glutathione peroxidaseなど抗酸化ストレスマーカー分子、炎症性サイトカインを初めとした各種パラメーターの変化を定量的に評価する。GTTアッセイ、グルコースクランプ法施行にてインスリン抵抗性の変動を評価する。これらと同様の検討を、肝細胞特異的CuZn-SOD欠損マウスとdb/dbマウスとの2重変異体も作成し施行する。さらに、これらの2重変異体マウスに、既に作成したCuZn-SOD過剰発現アデノウイルスを感染させることによるrescue実験も施行する。
Causes of Carryover	本研究費の使用用途は、実験使用マウスのgenotypeを決定するための試薬購入であった。当初の計画では、Cre-LoxPシステムを用いて作成した肝細胞特異的CuZn-SOD欠損マウスとob/obマウスとの2重変異体マウスを自然交配で作成する予定であったが、ob/obマウスが不妊であることからin vivo実験を行うのに必要な数のマウスを確保することができなかった。そのため、当初予定していたマウス作成数よりも実際に得られたマウス数が少なくなった。上記の理由で、次年度使用額が生じた。
Expenditure Plan for Carryover Budget	現在、遺伝子組換えマウスを体外受精と胚移植によって一度に大量に作成することを研究協力者に依頼している。次年度以降は、in vivo実験を行うための遺伝子組換えマウスを安定して確保できる予定である。次年度使用額は、これらマウスのgenotypeを決定するために必要な試薬の購入に使用する。