心不全における心筋細胞のheterogeneityの意義とその誘導因子の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K19371
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 野村 征太郎 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (10722118)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 循環器 / １細胞解析 / 遺伝子発現

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、心不全における心筋細胞の1細胞トランスクリプトームを時空間的に解析することで、心筋細胞の不均一性を生み出す要因を明らかにし、心不全の病態形成に寄与する 分子機構の 解明につなげることを目的としている。
まずマウス圧負荷心不全モデルマウスの心筋細胞を単離し、そこから抽出した心筋細胞から１細胞ごとにcDNAライブラリを作成するプロトコールを確立した。そして次世代シークエンサーを用いて１細胞ごとのRNAレベルを定量した（１細胞トランスクリプトーム）。そしてRNA定量を１分子RNA in situ hybridization法によっても確認し、心筋１細胞トランスクリプトーム解析の定量性を保証した。その後、コンピュータ解析によって特徴的な遺伝子発現の有無で細胞状態を分類することに成功し、圧負荷によって不均一に出現する細胞集団の存在を明らかにした。この細胞集団の存在は、蛍光免疫染色およびRNA in situ hybridization法によって確認した。そして重み付け共発現ネットワーク解析によって、この細胞集団で特異的に活性化するシグナルを同定し、そのシグナルを駆動する転写因子を明らかにした。さらにこの転写因子の心筋細胞特異的ノックアウトマウスを作成し、心機能を評価したところ、圧負荷をかけても心不全を生じないことがわかった。そしてこのマウスの心筋細胞を１細胞レベルで単離し、１細胞RNA-seq解析を行うことで、上記転写因子が不均一に心筋細胞内で活性化することによって乱れる遺伝子制御ネットワークを明らかにした。現在、圧負荷心不全によって心臓内で生じる非心筋細胞への影響も１細胞レベルの遺伝子発現解析により解析している。またヒトの心不全においても同様のことが生じているかを明らかにするため、ヒト心不全患者の心臓検体を用いて１細胞トランスクリプトーム解析を進めている。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

当初計画していた内容についてはほぼすべて遂行して結果が出つつあり、また予想以上に進行した部分が多かった。例えば遺伝子ネットワーク解析については、コンピュータ解析の進展が著しかったため、通常の統計解析に用いるアルゴリズム以外にも、重み付け共発現ネットワーク解析の使用にまで踏み切る事ができ、それにより非常に重要な結果を得た。さらに、重要な分子のノックアウトマウスも順調に作成するとともに、その解析も当初の予想を上まわる速度で進める事ができた。また当初は本研究の追加で行えると良いと考えていた、非心筋細胞の解析、ヒト心筋細胞の解析まで着手することができ、現在の進捗状況は計画以上と考えている。

Strategy for Future Research Activity

遺伝子ネットワーク解析については、重み付け共発現ネットワーク解析で様々な細胞集団を同定できることがわかったが、さらに遺伝子発現の因果関係を明らかにするような、ベイズネットワークへの展開を検討している。実際に１細胞RNA-seqデータへ応用可能なアルゴリズムを構築している。また圧負荷に伴った心筋細胞の肥大化が遺伝子発現とどう関連するかについても１細胞RNA-seqデータと形態的情報を統合することによって解析する。そして作成した重要な分子のノックアウトマウスの解析をさらに進めるとともに、非心筋細胞解析およびヒト心不全患者の心筋細胞解析をさらに進める。

Research Products

• [Journal Article] Wnt/β-Catenin Signaling Contributes to Skeletal Myopathy in Heart Failure via Direct Interaction With Forkhead Box O. (2015)
  • Author(s): Okada K, Naito AT, Higo T, Nakagawa A, Shibamoto M, Sakai T, Hashimoto A, Kuramoto Y, Sumida T, Nomura S, Ito M, Yamaguchi T, Oka T, Akazawa H, Lee JK, Morimoto S, Sakata Y, Shiojima I, Komuro I.
  • Journal Title: Circ Heart Fail. Volume: 8 Pages: 799-808
  • DOI: 10.1161/CIRCHEARTFAILURE.114.001958.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Monitoring β-arrestin recruitment via β-lactamase enzyme fragment complementation: purification of peptide E as a low-affinity ligand for mammalian bombesin receptors. (2015)
  • Author(s): Ikeda Y, Kumagai H, Okazaki H, Fujishiro M, Motozawa Y, Nomura S, Takeda N, Toko H, Takimoto E, Akazawa H, Morita H, Suzuki J, Yamazaki T, Komuro I, Yanagisawa M.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 10 Pages: e0127445
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0127445.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Quantitative Measurement of GPCR Endocytosis via Pulse-Chase Covalent Labeling. (2015)
  • Author(s): Kumagai H, Ikeda Y, Motozawa Y, Fujishiro M, Okamura T, Fujio K, Okazaki H, Nomura S, Takeda N, Harada M, Toko H, Takimoto E, Akazawa H, Morita H, Suzuki J, Yamazaki T, Yamamoto K, Komuro I, Yanagisawa M.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 28 Pages: e0129394
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0129394.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 心不全における心筋細胞の１細胞heterogeneityとその意義 (2015)
  • Author(s): 野村征太郎
  • Organizer: 第19回日本心血管内分泌代謝学会学術総会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-10 – 2015-12-12