2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K19415
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
古澤 春彦 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 助教 (40632154)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 鳥関連過敏性肺炎 / 質量分析 / ＩＧＬＬ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
過敏性肺炎は吸入抗原によるアレルギー性疾患であり、慢性過敏性肺炎は特発性肺線維症（IPF）と類似した臨床経過をとる予後不良な疾患である。慢性過敏性肺炎の原因として最も多いのは鳥糞や羽毛が原因となる鳥関連過敏性肺炎であるが、抗原となるエピトープは未だ同定されていない。今回我々は、鳥関連過敏性肺炎の原因抗原をハト組織と患者検体でwestern blotを行い質量分析により解析することで抗原となるタンパクを同定することとした。
まずハト血漿とハト糞抽出物の2次元電気泳動を行い、鳥関連過敏性肺炎患者と対照者（他の過敏性肺炎、特発性肺線維症、健常者）の血清を用いてwestern blotを行ったところ、鳥関連過敏性肺炎患者に特異的に反応するバンドを検出した。そのバンドを質量分析により解析した結果、Immunoglobulin lambda-like polypeptide（IGLL）と同定した。次に6Xヒスチジンタグと融合させたIGLLのベクターを合成し、大腸菌に遺伝子導入、発現を誘導したのちNi-NTAアガロースにて精製した。得られたIGLLのリコンビナントタンパクを用いて、患者と対照者の血清を用いてELISAを行ったところ、鳥関連過敏性肺炎患者で有意に高い反応性が認められた。
現在IGLLの細胞性免疫に与える影響を確認するため、患者と対照者の末梢血単核球（PBMC）にIGLLを添加し、リンパ球刺激試験と培養上清中のサイトカインの測定を開始したところである。リンパ球刺激試験は有意差を認めていないが鳥関連過敏性肺炎患者で高く反応する傾向が認められており、今後症例数を増やしていく予定である。また、Th1/Th2サイトカインを中心に培養上清のサイトカインを測定しており、こちらについても検討を継続する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度の研究は順調に進んでおり、鳥関連過敏性肺炎の原因抗原の同定、リコンビナントタンパクの合成を行うことができた。また、ELISAにより鳥関連過敏性肺炎患者の血清中でIGLL特異抗体が上昇していることも確認された。現在IGLLに対する細胞性免疫の検討を行っているところであるが、新しい知見が得られることが期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、IGLLの細胞性免疫に与える影響を確認するため、患者と対照者の末梢血単核球（PBMC）にIGLLを添加し、リンパ球刺激試験とマルチプレックスサイトカインアッセイを行っている。サイトカインはIL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p70, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-αを測定しているが、鳥関連過敏性肺炎患者においてTNF-αの上昇とIL-10の低下が認められている。IGLLに対する患者側のTh1/Th2反応の相違が発症に関与している可能性があり、症例数を増やして検討を続けていく。
また、次年度以降IGLLのモノクローナル抗体の作製を予定している。抗体を用いて患者肺検体中のIGLLの局在を確認することで、慢性鳥関連過敏性肺炎の病態を解明する一助となることを期待している。また、患者の自宅や環境中の抗原量を測定し、臨床的に抗原回避の効果確認に役立てることも予定している。
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| Causes of Carryover |
平成27年度中にリンパ球刺激試験ならびにマルチプレックスサイトカインアッセイを終了する予定であったが、鳥関連過敏性肺炎患者の症例数が当初見込まれたより少なかったため測定に滞りが生じた。とくにマルチプレックスサイトカインアッセイは1度に2-30例を測定するため、症例がある程度集積した後に測定する必要性があるため使用額に差異が生じる原因となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
リンパ球刺激試験の測定費用は1例あたり8000円であり、今後20例の測定を予定している。また、マルチプレックスサイトカインアッセイはBioPlex human cytokine Th1/Th2 9-plex panel（225000円）を用いて行う。平成28年度になり症例は徐々に集積されているため、本年度中に上記測定を行えると考えている。次年度使用額は上記検査の費用に充当する予定である。
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