新規治療法を目指したオートファジー・カテプシンの糸球体硬化進展への関与の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K19466
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 高木 美幸 順天堂大学, 医学部, 助教 (80599895)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: カテプシン / オートファジー / 糸球体硬化 / ポドサイト / ポドシン / エンドサイトーシス

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、ポドサイト特異的なAtg7欠損（KO）マウス、カテプシンKOマウスを使うことで、オートファジー・リソソーム経路による分解系関連蛋白と糸球体硬化進展メカニズムの関係解明を目的としている。本年度はポドサイト障害時のオートファジーの役割について検討を進めるべく、Atg7欠損マウスへの薬剤投与の観察と、オートファジー欠損時のポドサイトの変化について観察のため、Atg7欠損ポドサイトの作成観察を行う予定であった。
リソソーム分解に関連して、平静時スリット膜の裏打ち蛋白として存在するポドシンが糸球体硬化時に局在移動することと、これがエンドサイトーシス関連蛋白であるsorting nexin 9（SNX9）との結合により行われており、SNX9は糸球体硬化を来す疾患において有意に増加することを論文化することができた。エンドサイトーシス顆粒はリソソーム分解系に関連するため、次年度はカテプシン欠損マウスにおけるエンドサイトーシス関連蛋白の観察を元にカテプシン欠損時のエンドサイトーシスと糸球体硬化との関連の解明を目指し、論文化していく予定である。
オートファジー関連については、Atg7KOマウスへのアドリアマイシン（ADR）腎症惹起、リポポリサッカリド（LPS）腎症惹起により、KOマウスにおいて有意に蛋白尿が増悪することを確認しているが、その障害メカニズム解析のためAtg7KOマウスから採取したポドサイトを元にオートファジー欠損ポドサイトを作成することに成功し、この観察により大変興味深い結果がみられている。次年度は最終年度であり、この結果をまとめ論文化することを目標とする。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

28年度の研究により、リソソーム分解に関連して、平静時スリット膜の裏打ち蛋白として存在するポドシンが糸球体硬化時の局在移動と、これがエンドサイトーシス関連蛋白であるsorting nexin 9（SNX9）との結合により行われており、糸球体硬化時に増大することを論文化することができた。エンドサイトーシス顆粒はリソソーム分解系で分解されるため、カテプシン欠損によるポドサイト障害への影響の解明についても、糸球体硬化とカテプシン・オートファジーとの関連を観察するために有益と考えられた。また、オートファジー関連についても、ポドサイト障害メカニズム解析のためAtg7KOマウスから採取したポドサイトを元にオートファジー欠損ポドサイトを作成することに成功し、この観察により大変興味深い結果がみられている。
カテプシンマウスを使っての検討は進行中であるが、28年度はエンドサイトーシスとリソソーム系、糸球体硬化との関連を示唆する結果を得ることができ、糸球体硬化進展メカニズム解明に新たな視点を得られたことから、課題はおおむね順調に進行していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

28年度までに得られた結果を元に、最終年度にまとめるべく、カテプシン関連についてはカテプシン欠損マウスにおけるエンドサイトーシス関連蛋白の観察を元にカテプシン欠損時のエンドサイトーシスと糸球体硬化との関連の解明を目指し、論文化していく予定である。オートファジー関連については、28年度に作成したオートファジー欠損ポドサイトの観察によりAtg7KOマウス観察の結果についての検証を行い、まとめる予定である。
本研究でえられた結果は、学内の研究協力者と適宜討論を行い、研究成果を学会、欧米紙等に随時発表していくことを考えている。

Causes of Carryover

28年度はエンドサイトーシスに関連したSNX9の観察を元に、新たな視点からリソソーム系と糸球体硬化との関連性を示唆する結果を得ることができた反面、予定していたカテプシンマウスへの薬剤投与実験が予定から遅れ次年度に向けて進行中であり、マウス維持と観察のための諸費用が繰り越しとなったため。また、オートファジー欠損ポドサイト作成後に予定していたマイクロアレイの網羅的解析が繰り越されたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

消耗品：Atg7KOポドサイト解析のためのマイクロアレイによる網羅的解析費用、カテプシン、オートファジー関連蛋白検出に必要な各種抗体の購入、蛋白、RNA抽出用キット等の購入を検討している。またマウスの腎障害評価のため、マウス維持費他、蛋白尿の定量化のためのアルブミン尿測定キット購入、組織評価のための蛋白、RNA抽出キット購入も昨年に続いて必要である。
旅費等：論文化、研究成果の国内外での学会発表等にかかる諸費用

Research Products

• [Journal Article] Sorting Nexin 9 facilitates podocin endocytosis in the injured podocyte. (2017)
  • Author(s): Sasaki Y, Hidaka T, Ueno T, Akiba-Takagi M, Trejo JA, Seki T, Nagai-Hosoe Y, Tanaka E, Horikoshi S, Tomino Y, Suzuki Y, Asanuma K.
  • Journal Title: Scientific reports Volume: 7 Pages: 43921
  • DOI: 10.1038/srep43921.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant