miRNAを指標としたALS患者運動神経細胞でのTDP-43機能喪失仮説の検証

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K19480
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 志賀 篤 新潟大学, 研究推進機構, 講師 (00736952)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: ALS / TDP-43 / miRNA

Outline of Annual Research Achievements

筋委縮性側索硬化症 (ALS) では，運動神経細胞において，核蛋白TDP-43の核内からの消失を認める．よって病態機序として，TDP-43のmRNAやmiRNAに対する機能喪失による運動神経細胞死，が提唱されている．しかし，TDP-43の核内局在が消失したALS患者運動神経細胞にて，TDP-43のRNAに関連する機能が低下しているかは明らかでない．本申請ではmiRNAの安定性を利用し，核内局在の消失したALS患者運動神経細胞でのTDP-43機能を評価することを目的とする．
本年度は，運動神経細胞におけるTDP-43機能を反映するmiRNA発現変化の同定を試みた．申請者はすでに，神経系の細胞特異的にTDP-43発現を低下させたTDP-43コンディショナルノックアウトマウスを使用した検討を行っており，野生型に比して，9個のmiRNAで有意な発現変化を確認している．一方，マウスとヒトでは，TDP-43がmiRNA発現に与える影響が異なる可能性がある．そこで本年度は，ヒトiPS細胞より分化させた運動神経細胞を対象とした検討を行うための，分化誘導法の検討を行った．既報に従い分化誘導を行い，結果，運動神経マーカーであるChATやHb9の発現を，RT-PCR法やウェスタンブロット法にて確認した．また，TDP-43遺伝子をノックアウトしたヒト運動神経細胞の作製に備えるため，AAVS1遺伝子座に，ドキシサイクリン誘導性にCas9タンパクを発現するためのカセットを挿入したヒトiPS細胞を樹立し，これが運動神経細胞に分化することを確認した．